Rab5a在頭頸鱗癌中過表達(dá)并通過ERK-MMP通路促進(jìn)侵襲.pdf

1、目的：頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在逐年攀升。針對頭頸鱗癌，臨床上主要采取手術(shù)的方法進(jìn)行治療，雖然診斷以及輔助治療方法在不斷改進(jìn)，其預(yù)后情況與其他惡性腫瘤相比仍然不容樂觀。不僅如此，頭頸鱗癌的術(shù)后通常導(dǎo)致大面積的組織缺損，目前臨床采用不同材料對缺損的組織進(jìn)行修復(fù)，對修復(fù)材料進(jìn)行抗癌基因修飾可能是未來修復(fù)材料的研究趨勢。因此，探索

2、頭頸鱗癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找針對頭頸鱗癌的治療靶點(diǎn)對頭頸鱗癌診療以及術(shù)后缺損組織的修復(fù)有重要意義。Rab分子是維持細(xì)胞膜表面物質(zhì)交換的重要蛋白，并主要承擔(dān)生命體囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的職責(zé)。在囊泡運(yùn)輸過程中Rab負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)靶向運(yùn)輸，囊泡拴系，與靶膜泊位及融合，此外還有部分Rab能夠調(diào)節(jié)囊泡的芽生。囊泡運(yùn)輸發(fā)生障礙時，不同功能的蛋白將無法到達(dá)預(yù)期位置，導(dǎo)致機(jī)體功能紊亂，誘發(fā)各種疾病。研究顯示Rab家族與腫瘤關(guān)系密切，并在多種癌組織中表達(dá)異常，如Rab

3、31在乳腺癌，Rab3在神經(jīng)腫瘤，Rab23在肝細(xì)胞癌等。目前，已有多個研究報道了Rab分子在頭頸腫瘤中的重要作用。起初，Shimada等人于舌癌及癌前病變組織的基因微陣列研究中發(fā)現(xiàn)了Rab1a的異常表達(dá)現(xiàn)象。隨后有研究顯示Rab2a的表達(dá)水平同樣與舌癌的發(fā)生密切相關(guān)。近年有研究在轉(zhuǎn)移的頭頸鱗癌細(xì)胞系中過表達(dá)Rab25后發(fā)現(xiàn)其能夠明顯削弱頭頸鱗癌細(xì)胞在含有膠原基質(zhì)的三維環(huán)境中的侵襲能力，不僅如此，Rab25通過抑制細(xì)胞表面突出結(jié)構(gòu)pro

4、trusive的形成影響小鼠子宮腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。最近研究顯示Rab偶聯(lián)蛋白(Rab coupling protein，RCP)在頭頸鱗癌組織中過表達(dá)，其表達(dá)水平與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、復(fù)發(fā)及預(yù)后等臨床病理資料密切相關(guān)。Rab5a隸屬于Rab GTP酶蛋白家族，在內(nèi)吞、胞吐以及囊泡運(yùn)輸過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。近年來，多篇文章報道了Rab5a蛋白在人類的惡性腫瘤中的重要作用——研究發(fā)現(xiàn)Rab5a在乳腺癌以及卵巢癌中過表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤

5、細(xì)胞的增殖和侵襲能力密切相關(guān)。還有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)Rab5a在肺癌、胃癌以及肝細(xì)胞癌中的表達(dá)量顯著上調(diào)。近期，一項(xiàng)基因微陣列的研究結(jié)果顯示Rab5與Rab7及Rab11在轉(zhuǎn)移性口腔鱗癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）中表達(dá)異常，它們通過分解黏著斑(Focal adhesion，F(xiàn)A)促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，三者共同過表達(dá)是口腔鱗癌患者不良預(yù)后的重要影響因素。以上報道均提示Rab5a在人類惡性腫瘤中發(fā)揮作用。然而

6、，Rab5a在頭頸鱗癌中的臨床意義及生物學(xué)作用并不明確。
　　方法：⑴檢測Rab5a蛋白在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)情況，探究其表達(dá)的臨床意義。樣本及臨床資料的收集:組織樣本來自2014-2016年間于中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院手術(shù)切除并由病理確診為頭頸鱗狀細(xì)胞癌的病理組織共79例，并取10例癌旁非腫瘤組織作為對照?；颊叩呐R床資料取自于本院檔案室患者的醫(yī)療記錄。免疫組織化學(xué)法檢測79例頭頸鱗癌組織及10例癌旁非腫瘤組織中Rab5a蛋白的表

7、達(dá)水平。對79例頭頸鱗癌患者的臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計、整理，分析Rab5a表達(dá)水平與患者的性別、年齡、腫瘤組織的分化程度、T分期、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征的關(guān)系。⑵過表達(dá)及沉默Rab5a對頭頸鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。Western blot法檢測頭頸鱗癌細(xì)胞系中Rab5a蛋白的表達(dá)水平，篩選后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞株。通過瞬時轉(zhuǎn)染Rab5a質(zhì)粒及siRNA過表達(dá)和沉默頭頸鱗癌細(xì)胞中的Rab5a，分別建立Rab5a過表達(dá)及沉默的細(xì)胞模型。

8、Real-time PCR及Western blot法在mRNA及蛋白水平驗(yàn)證過表達(dá)及沉默效果。過表達(dá)實(shí)驗(yàn)分為Rab5a plasmid組及對照Empty vector組;沉默實(shí)驗(yàn)分為Rab5a siRNA組及對照Negative siRNA組。將各組頭頸鱗癌細(xì)胞分別進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)及集落形成實(shí)驗(yàn)，檢測Rab5a對頭頸鱗癌細(xì)胞增殖水平及集落形成能力的影響。流式細(xì)胞分析法檢測各組頭頸鱗癌細(xì)胞周期水平，探究Rab5a對頭頸鱗癌細(xì)胞周期分布的影

9、響。各組頭頸鱗癌細(xì)胞分別進(jìn)行基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測Rab5a對頭頸鱗癌侵襲能力的影響。Hoechst染色法檢測Rab5a對各組頭頸鱗癌細(xì)胞凋亡的影響。⑶探索Rab5a促進(jìn)頭頸鱗癌細(xì)胞增殖及侵襲的作用途徑。Western blot法檢測過表達(dá)及沉默Rab5a后頭頸鱗癌細(xì)胞內(nèi)重要周期調(diào)控蛋白cyclin D1、cyclinE及ERK/MMP通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。在KB細(xì)胞中過表達(dá)Rab5a，應(yīng)用特異性阻斷劑PD98059阻斷胞內(nèi)ERK后檢測

10、p-ERK、MMP-2的表達(dá)，驗(yàn)證Rab5a通過ERK途徑調(diào)控MMP-2表達(dá)。Western blot法檢測過表達(dá)或沉默頭頸鱗癌細(xì)胞內(nèi)Rab5a后E-cadherin、Snail以及Vimentin蛋白的表達(dá)水平，檢測Rab5a對頭頸鱗癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程的作用，從另一角度解析Rab5a促進(jìn)頭頸鱗癌侵襲的途徑。
　　結(jié)果：①Rab5a在頭頸鱗癌組織中

11、的表達(dá)水平及其臨床意義:79例頭頸鱗癌組織中有39例(49.37％)為Rab5a高表達(dá)，10例癌旁非腫瘤組織中均未見Rab5a呈高表達(dá);分析79例頭頸鱗癌患者的臨床資料發(fā)現(xiàn)Rab5a的高表達(dá)與腫瘤較低的分化程度，較高的TNM分期，較高的T分級以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(p＜0.05)。②Rab5a對頭頸鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲等生物行為的影響:MTT結(jié)果表明過表達(dá)Rab5a使頭頸鱗癌細(xì)胞增殖水平提高，而沉默該基因使細(xì)胞增殖水平下降;集落形成實(shí)驗(yàn)表

12、明過表達(dá)Rab5a提高了頭頸鱗癌細(xì)胞的集落形成能力，而沉默Rab5a能夠抑制細(xì)胞的集落形成能力;細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)Rab5a使頭頸鱗癌細(xì)胞的S期比例增加，G1期比例下降，沉默Rab5a后細(xì)胞的G1期比例增加，S期比例下降;基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明過表達(dá)Rab5a后可提高頭頸鱗癌細(xì)胞的侵襲能力，而沉默Rab5a使細(xì)胞的侵襲能力受到抑制;Hochest染色結(jié)果顯示，各組細(xì)胞凋亡水平較為一致，Rab5a可能并不影響頭頸鱗癌細(xì)胞的凋亡過程。③

13、Rab5a對頭頸鱗癌細(xì)胞中cyclinD1，cyclinE以及MMP-2表達(dá)的影響:過表達(dá)Rab5a能夠上調(diào)頭頸鱗癌細(xì)胞中cyclin D1，cyclin E以及MMP-2的表達(dá)水平，而沉默Rab5a后，cyclin D1，cyclin E以及MMP-2的表達(dá)量顯著下調(diào)。④Rab5a與頭頸鱗癌細(xì)胞內(nèi)ERK/MMP-2通路的關(guān)系:Rab5a提高了頭頸鱗癌細(xì)胞中ERK的磷酸化水平，ERK抑制劑PD98059可有效消除Rab5a對ERK/MM

14、P-2的調(diào)控作用。5、Rab5a與頭頸鱗癌細(xì)胞EMT的關(guān)系:過表達(dá)Rab5a促進(jìn)頭頸鱗癌細(xì)胞內(nèi)Snail及Vimentin的表達(dá)而抑制E-cadherin的表達(dá);沉默Rab5a后，E-cadherin的表達(dá)水平上調(diào)，Snail及Vimentin的蛋白表達(dá)水平下調(diào)。
　　結(jié)論：⑴在頭頸鱗癌組織中Rab5a的表達(dá)量發(fā)生上調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、TNM分期、T分級以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。⑵Rab5a促進(jìn)頭頸鱗癌細(xì)胞增殖，克隆形成，推