烏賊墨多糖聯(lián)合順鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡與自噬的作用機(jī)制研究.pdf

1、SIP是從金烏賊(Sepia esculenta Hoyle)墨內(nèi)分離純化得到的一種活性較高、結(jié)構(gòu)新穎的多糖。藥理學(xué)活性研究表明，SIP具有較高的免疫增強(qiáng)、抗氧化和抗腫瘤活性，可通過(guò)調(diào)節(jié)與凋亡有關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其抗腫瘤作用。為提高抗腫瘤療效而不增加毒性，并且降低腫瘤耐藥程度，多采用幾種抗癌藥物聯(lián)合作用的方式治療，以發(fā)揮藥物間的協(xié)同作用。順鉑(Cis-dischlorodiammine-platinm，DDP)是一種金

2、屬鉑類(lèi)絡(luò)合物，對(duì)大多數(shù)腫瘤細(xì)胞都有一定的殺傷作用，是一種臨床上最常用的化學(xué)藥物，但當(dāng)其濃度較高時(shí)會(huì)對(duì)機(jī)體有一定毒性作用。乳腺癌(Carcinoma of thebreast)是全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤疾病，每年大約有120萬(wàn)婦女罹患乳腺癌，50萬(wàn)人死于乳腺癌，并且這個(gè)數(shù)字仍在不斷上升。癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是造成乳腺癌難以徹底治愈的的重要原因，很多患者并不是死于原發(fā)性癌癥，而是死于后期轉(zhuǎn)移性癌癥。
　　本研究采用MDA-MB-231細(xì)胞作

3、為體外實(shí)驗(yàn)的DDP化療模型，并利用SIP作為化療藥物DDP的保護(hù)劑和增敏劑，觀察并分析兩種藥物單用及聯(lián)用時(shí)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)移、凋亡和自噬的影響。
　　實(shí)驗(yàn)利用中效原理篩選出合適的用藥劑量并對(duì)比藥物劑量-效應(yīng)關(guān)系;結(jié)果發(fā)現(xiàn)DDP單獨(dú)應(yīng)用時(shí)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞有一定抑制作用，其中效濃度為4.9μg/ml，SIP單獨(dú)應(yīng)用時(shí)同樣對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞具有一定抑制效應(yīng)，中效濃度為1659.6μg/ml。當(dāng)DDP與SIP

4、聯(lián)合作用時(shí)，其對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的中效濃度大大小于兩藥單用的中效濃度之和。說(shuō)明兩藥聯(lián)用時(shí)各藥僅需較少劑量便可達(dá)到較高抑制效果，減少了DDP單用時(shí)產(chǎn)生的耐藥性以及對(duì)機(jī)體造成的毒性損傷。
　　其次依據(jù)單細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞傷痕實(shí)驗(yàn)從表觀上觀察藥物對(duì)細(xì)胞遷移能力影響，并根據(jù)Western blot結(jié)果分析其分子機(jī)理，在單細(xì)胞克隆和細(xì)胞傷痕實(shí)驗(yàn)中，DDP與SIP兩種藥物單用及聯(lián)用都能對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移能力有一定抑制作用，雖然SIP的抑

5、制作用弱于DDP，但作為輔助化療藥物DDP的增敏劑，兩藥聯(lián)用時(shí)其抗轉(zhuǎn)移效果達(dá)到最佳與兩藥單用時(shí)相比有極顯著差異（P＜0.01），western blot實(shí)驗(yàn)中SIP+DDP組抑制MMP-2、MMP-9效果均好于兩藥單用時(shí)，可極顯著降低兩個(gè)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)。在藥物作用過(guò)程中，兩藥相互促進(jìn)提高抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的效果。
　　以Hochest33242/PI雙染觀察并檢測(cè)藥物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響，并根據(jù)Western

6、blot結(jié)果分析凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從Hochest33242/PI雙染檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，SIP與DDP都能誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生凋亡，但SIP誘凋亡水平相對(duì)DDP較弱，當(dāng)兩藥聯(lián)用時(shí)，其促凋亡水平相對(duì)兩藥單獨(dú)應(yīng)用時(shí)得到極大提升。western blot結(jié)果分析，SIP與DDP通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax基因比率以及Caspase蛋白酶的表達(dá)，介導(dǎo)凋亡現(xiàn)象的發(fā)生。
　　利用MDC染色觀察藥物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞自噬的影響，

7、并根據(jù)Western blot結(jié)果分析自噬相關(guān)蛋白與PI3K-Akt和p38MAPK信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子的表達(dá)情況，還初步討論藥物作用下MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生凋亡與自噬的相互影響及分子機(jī)理。由MDC染色結(jié)果分析，DDP能夠誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞自噬，但SIP+DDP組自噬率明顯低于DDP組，且兩組之間差異顯著（P＜0.05），由此推斷，SIP可一定程度緩解DDP引起的腫瘤細(xì)胞自噬。western blot結(jié)果分析，與DDP

8、組相比，3-MA+DDP組和SIP+DDP組中，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)變程度均降低，LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平也極顯著下降(P＜0.01)，而B(niǎo)eclin-1蛋白表達(dá)水平均也表現(xiàn)為極顯著（P＜0.01）降低現(xiàn)象。結(jié)合凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)與PI3K-Akt和p38MAPK信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子p-Akt和p-p38的表達(dá)情況來(lái)看，DDP能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬，且可從PI3K-Akt和p38MAPK途徑調(diào)控，前者可誘導(dǎo)自噬拮抗凋亡，后者自噬和凋