半乳糖激酶和半乳糖異構(gòu)酶的生物化學研究.pdf

1、莢膜是肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，SP)的重要組成成份，GalK、GalE1和GalE2蛋白是肺炎鏈球菌莢膜合成中的關鍵酶，用于合成莢膜寡糖重復單位前體UDP-Gal。莢膜在肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，SP)的感染過程中保護致病菌免受宿主免疫系統(tǒng)的識別，它是宿主產(chǎn)生免疫反應的結(jié)構(gòu)基礎。莢膜蛋白和多糖已經(jīng)開始被作為治療藥物研究，但是單純的多糖半抗原并不能誘導免疫記憶；將致

2、病菌表面多糖共價連接到載體蛋白后形成的糖綴合物疫苗是目前糖藥物開發(fā)的前沿之一。
　　 我們克隆了來自4型肺炎鏈球菌的半乳糖激酶(Galactokinase.GalK)，IPTG誘導GalK蛋白在Ecoli BL21(DE3)中表達，帶有N-端his6標簽的GalK蛋白經(jīng)過Ni-NTA柱和分子篩純化，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，GalK純度達到90％以上，單體分子的表觀分子量約為37 kDa，與理論推導值基本一致。生物化學及酶學

3、性質(zhì)分析表明肺炎鏈球菌GalK蛋白的最適pH為7.5，最適反應溫度為450C。4型肺炎鏈球菌半乳糖激酶的動力學數(shù)據(jù)表明，GalK突變體176，1764和176423的定點突變增加了酶對Gal的轉(zhuǎn)化效率；GalK突變體1764,17642和176423的定點突變增加了酶對GIc的轉(zhuǎn)化效率；突變體1764,17642對GIcNAc轉(zhuǎn)化效率相近。ATP不是該酶的唯一磷酸基供體，CTP，dATP，dTTP和dUTP也能被GalK蛋白利用。Gal

4、K蛋白催化Gal的轉(zhuǎn)化率為100％，使用3，5-二硝基水楊酸(DNS)分析和計算GalK蛋白野生型及4個突變體176，1764，17642和176423對其余單糖的轉(zhuǎn)化率和活力。4型肺炎鏈球菌GalK的3個突變體1764，17642和176423在體外能以葡萄糖為底物，而野生型GalK蛋白在體外不能以葡萄糖為底物；利用對葡萄糖轉(zhuǎn)化率較好的GalK突變體176423對葡萄糖進行催化反應，使用3，5-二硝基水楊酸(DNS)顯色法與薄層層析(

5、TLC)檢測到產(chǎn)物葡萄糖-1-磷酸的生成，反應混合物經(jīng)硅膠柱純化并用ESI-MS驗證。當磷酸基供體為ATP，糖基供體由半乳糖換為N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺或巖藻糖或阿拉伯糖或鼠李糖，催化反應后使用3，5-二硝基水楊酸(DNS)顯色法與薄層層析(TLC)檢測產(chǎn)物糖-1-磷酸的生成，并使用MALDI-TOF或IH-NMR或ESI-MS分析。當磷酸基供體換為CTP或dATP或dTTP或dCTP或dUTP，受體為半乳糖，催化反應后使用3

6、，5-二硝基水楊酸(DNS)顯色法與薄層層析(TLC)檢測產(chǎn)物半乳糖-1-磷酸的生成，產(chǎn)物經(jīng)ESI-MS分析。
　　 同時我們克隆了來自4型肺炎鏈球菌的半乳糖異構(gòu)酶(UDP-galactose4-epimerase，GalE)，IPTG誘導GalE1和GalE2蛋白在Ecoil BL21(DE3)中表達，帶有N-端his6標簽的GalE1和GalE2蛋白經(jīng)過Ni-NTA柱和分子篩純化，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，GalE1和G

7、alE2蛋白純度達到90％以上，單體分子的表觀分子量約為37 kDa，與理論推導值基本一致。生物化學分析表明4型肺炎鏈球菌GalE1和GalE2蛋白的最適pH為8.0，最適反應溫度為370C。以UDP-Gal，UDP-GalNAc，UDP-GIc，UDP-GIcNAc為底物進行GalE1和GalE2的底物特異性分析，產(chǎn)物峰用毛細管電泳(CE)檢測。UDP-Gal和UDP-GIc是GalE1和GalE2的天然底物，用于驗證GalE1和Ga