小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞凋亡及凋亡基因表達(dá)的檢測(cè).pdf

1、早期胚胎發(fā)育過(guò)程當(dāng)中伴隨著大量的發(fā)育異常的細(xì)胞，尤其在體外培養(yǎng)過(guò)程中更為普遍。細(xì)胞凋亡是體細(xì)胞中清除發(fā)育異常細(xì)胞的重要途徑之一，研究表明，早期胚胎當(dāng)中異常細(xì)胞的清除也是通過(guò)細(xì)胞凋亡的途徑實(shí)現(xiàn)的。著床前胚胎當(dāng)中凋亡現(xiàn)象普遍存在，即使是形態(tài)正常的胚胎當(dāng)中也存在凋亡細(xì)胞，而細(xì)胞凋亡的發(fā)生是凋亡基因的表達(dá)的直接結(jié)果。胚胎細(xì)胞大比率的凋亡對(duì)胚胎的生長(zhǎng)是不利的，為了提高體外培養(yǎng)胚胎的存活能力，人們通過(guò)改變培養(yǎng)條件，添加生長(zhǎng)因子來(lái)抑制胚胎細(xì)胞的凋亡。

2、 各種生長(zhǎng)因子影響胚胎發(fā)育能力的研究已有大量的報(bào)道，但這些研究大多停留于各時(shí)期胚胎發(fā)育率的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，而對(duì)各種生長(zhǎng)因子對(duì)胚胎作用的分子機(jī)制沒(méi)有做進(jìn)一步的深入研究。尤其對(duì)早期胚胎發(fā)育過(guò)程當(dāng)中生長(zhǎng)因子與凋亡基因表達(dá)變化之間的關(guān)系研究的更少。對(duì)早期胚胎發(fā)育過(guò)程中凋亡基因表達(dá)變化的研究對(duì)于揭示早期胚胎發(fā)育機(jī)制有重要的意義。 本實(shí)驗(yàn)采用彗星電泳、改進(jìn)后的胚胎RNA提取方案結(jié)合巢式RT-PCR、免疫化學(xué)染色的方法，對(duì)小鼠體內(nèi)早期胚

3、胎在發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞凋亡情況及凋亡基因Bcl-2家族的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。同時(shí)檢測(cè)了IGF-1在體外培養(yǎng)條件下對(duì)小鼠胚胎細(xì)胞凋亡及凋亡基因Bcl-2家族(Bax、Bcl-2、Bak、Bcl-xl)表達(dá)的影響，初步揭示了IGF-1可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家族基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，提高了小鼠胚胎的質(zhì)量和胚胎的發(fā)育率。這對(duì)于揭示早期胚胎發(fā)育機(jī)制機(jī)理以及獲得更多的優(yōu)質(zhì)胚胎有重要的意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 1.在國(guó)內(nèi)同類(lèi)

4、研究中率先使用彗星電泳的方法檢測(cè)早期胚胎當(dāng)中的凋亡現(xiàn)象。彗星電泳結(jié)果表明早期胚胎發(fā)育過(guò)程中廣泛存在凋亡，不同發(fā)育時(shí)期的形態(tài)正常的胚胎當(dāng)中存在凋亡細(xì)胞。 2.采用改進(jìn)的胚胎細(xì)胞總RNA提取方案，應(yīng)用少量胚胎提取總RNA，使用巢式PCR的方法檢測(cè)到Bcl-2家族當(dāng)中4個(gè)基因(Bax、Bcl-2、Bak、Bcl-xl)在小鼠胚胎發(fā)育的早期表達(dá)，且表達(dá)情況隨發(fā)育時(shí)期的不同而變化。 3.體外無(wú)血清培養(yǎng)條件下，凋亡胚胎比率上升，

5、并且Bax基因在桑椹胚期表達(dá)量上升，而B(niǎo)cl-2基因的表達(dá)量降低。 4.100ng/mlIGF-1能夠促進(jìn)小鼠胚胎的生長(zhǎng)，提高各時(shí)期胚胎發(fā)育比率及囊胚發(fā)育率，降低凋亡胚胎比率。 5.在同類(lèi)研究中首次直接證明，IGF-1對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中Bcl-2家族Bcl-2及Bcl-xl基因的表達(dá)有明顯的影響。100ng/mlIGF-1能夠上調(diào)桑椹胚期Bcl-2基因的表達(dá)以及桑椹胚期和囊胚期Bcl-xl的表達(dá)量;對(duì)促凋亡基因