雙功能β-葡聚糖酶-木聚糖酶與β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶的優(yōu)化構(gòu)建及其酶學(xué)特性分析.pdf

1、β-葡聚糖酶(Glu)、木聚糖酶(Xyl)和植酸酶(Phy)是飼用復(fù)合酶制劑的常規(guī)組分,用于消除日糧中最重要的三種抗?fàn)I養(yǎng)因子--β-葡聚糖、木聚糖和植酸(鹽),以提高飼料營養(yǎng)素的生物利用率。復(fù)合酶制劑一般是將分別生產(chǎn)的各種酶進行混配生產(chǎn),通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)雙(或多)功能酶將大大降低復(fù)合酶制劑的生產(chǎn)成本。因此,本研究以上述三種酶的基因為出發(fā)點,分別進行了β-葡聚糖酶-木聚糖酶和β-葡聚糖酶-植酸酶兩兩間無連接肽的頭尾相連融合,繼而在對融

2、合酶和親本酶定性比較的基礎(chǔ)上進行了連接肽的優(yōu)化篩選。通過在擬融合的兩個功能單位之間嵌入適當(dāng)?shù)亩嚯?獲得了兩個功能單位的催化特性均顯著提高的β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶和成功表達雙功能活性的β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶。主要研究內(nèi)容和結(jié)果分述如下： β-葡聚糖酶-木聚糖酶和β-葡聚糖酶-植酸酶無連接肽融合酶構(gòu)建應(yīng)用基因重疊延伸技術(shù)(splicing-by-overlap extensiort,SOE),分別構(gòu)建了β-葡聚糖酶-木聚糖

3、酶和β-葡聚糖酶-植酸酶無連接肽融合酶的基因gx和gp,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,均獲得成功表達。融合酶gx表現(xiàn)出同時具有β-葡聚糖酶和木聚糖酶兩種酶活的雙功能。酶學(xué)特性分析表明,與親本酶相比,融合酶gx的Glu部分的催化效率(K_(cat)/K_(m)=6492)達到親本酶(K_(cat)/K_(m)=1563)的4.15倍,而Xyl部分的催化效率(K_(cat)/K_(m)=903)卻只有親本(K_(cat)/K_(m)=1311)的

4、69％。除Glu部分的熱穩(wěn)定性不如親本外,融合酶gx所有酶學(xué)特性(最適溫度、最適pH及耐酸堿的穩(wěn)定性)均類似于親本。但是,融合酶gp檢測不出β-葡聚糖酶和植酸酶任一親本的活性。由此暗示,融合酶的功能單位間存在不一定不利的互作,通過適當(dāng)連接肽的嵌入,使兩單位間保持合適的距離,有可能獲得兩個功能單位效率均得到提高的β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶。對融合酶gp而言,兩個功能單位的活性喪失,有可能與兩兩間的過分靠攏有關(guān),所以嵌入適當(dāng)連接肽也有可能

5、獲得同時具有β-葡聚糖酶和植酸酶活性的β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶。 連接肽的優(yōu)化與β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶基因的構(gòu)建以柔性肽[GGGGS]_n(n≤3)和具有α-螺旋的剛性肽[EAAAK]_n(n≤3)以及另兩條多肽為連接肽,構(gòu)建β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶基因,其中編碼(GGGGS)_3的五個堿基序列包括S3、S3-1、S3-2、S3-3和S3-4。應(yīng)用SOE技術(shù)構(gòu)建融合酶基因12個,獲得了表現(xiàn)雙功能活性的8個融合蛋白GI

6、u-S3-Xyl、Glu-S2-Xyl、Glu-Sl-Xyl、Glu-S-Xyl、Glu-H-Xyl、Glu-α3-Xyl、Glu-α2-Xyl和Glu-αl-Xyl,但連接肽S3-1、S3-2、S3-3和S3-4對應(yīng)的融合酶基因未能在BL21中正常表達。上述結(jié)果顯示,富含GC的(GGGGS)3堿基編碼序列區(qū)域可能會因為形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致融合基因的翻譯效率降低。此外,由mRNA翻譯過程中核糖體A和P位上相鄰兩個氨酰-tRNA同工受

7、體的兼容性引起密碼子對的偏愛性,也可能直接影響mRNA的解碼速度和準(zhǔn)確性。因此,在連接肽的氨基酸殘基序列組成確定的情況下,其堿基編碼序列的設(shè)計也須給予足夠重視。連接肽對雙功能β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶的影響通過硫酸銨分級沉淀、緩沖液(pH 5.0)沉淀及陽離子交換等步驟,分別純化了8個具有雙功能的β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶,并對其進行了雙功能酶學(xué)特性分析。與親本相比,所有融合酶Glu部分的催化效率(Kcat/Km：4748-6658

8、)均優(yōu)于親本(Kcat/Km=1563),分別達到親本的3.0-4.3倍；而融合酶Xyl部分的催化效率(Kcat/Km=1073-1875)達到親本的82％-143％,均高于無連接肽的gx對應(yīng)部分(Kcat/Km=903)。連接肽S2的融合效果最佳,融合酶Glu-S2-Xyl的Glu和Xyl部分的催化效率分別比親本提高了326％和43％；其次是α3作為連接肽的融合酶Glu-α3-Xyl,其Glu和Xyl的催化效率分別高于親本262％和3

9、1％。結(jié)果表明,通過嵌入適當(dāng)?shù)倪B接肽,使融合酶的兩個功能單位形成有益的互作,可以達到雙功能催化效率都優(yōu)于親本的效果。不同結(jié)構(gòu)類型的柔性肽(如S2)和具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的剛性肽(如α3)都有可能實現(xiàn)雙優(yōu)的結(jié)果。結(jié)構(gòu)類型相同的連接肽的長度也在一定程度上影響融合酶兩個功能單位的催化效率。因此,連接肽的篩選對于融合蛋白的構(gòu)建是完全必要的。 β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶基因的優(yōu)化構(gòu)建以柔性肽(GGGGS)2、(GGGGS)3和α-螺旋剛性肽(

10、EAAAK)1及(EAAAK)2為連接肽,構(gòu)建4個β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶基因,并分別在BL21中成功表達4個β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶蛋白Glu-S2-Phy、Glu-pS3-Phy、Glu-αl-Vhy及Glu-α2-Phy。其中,后三者表現(xiàn)出雙功能活性,而Glu-S2-Phy僅具有β-葡聚糖酶活性。根據(jù)所用連接肽的氨基酸殘基數(shù),本研究中柔性和剛性兩類連接肽在β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶中的折疊類型必然有所不同。結(jié)合連接肽S2對應(yīng)融

11、合酶GIu-S2-Xyl的雙功能催化效率最佳的事實,證明連接肽的選擇與需融合的兩親本酶結(jié)構(gòu)及大小之間存在關(guān)聯(lián)。 綜上所述,本研究的主要結(jié)果,一是通過連接肽的優(yōu)化篩選而獲得了三個Glu及Xyl部分催化效率均大幅或顯著提高的雙功能β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合酶,說明篩選出的連接肽使融合酶的兩個功能單位形成了合理的有利互作。二是獲得了三個具有雙功能的β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶,并由此證明連接肽的選擇與所需融合的兩個功能蛋白的結(jié)構(gòu)和大小相