篩選吳茱萸中的β1腎上腺素受體抑制劑及考察其對缺血心肌能量代謝的改善作用.pdf

1、目的：
　　持久地興奮β1腎上腺素受體（β1-AR）會使心肌收縮增強，心率加快，最終導(dǎo)致心肌能量代謝紊亂、ATP供應(yīng)不足，心肌功能受損。本課題利用β1腎上腺素受體細胞膜色譜法（β1-AR/CMC）篩選吳茱萸中與β1-AR相結(jié)合的活性成分，再將活性成分用超高效液相-質(zhì)譜（UPLC/MS）進行鑒定，得到吳茱萸中對β1-AR具有抑制作用的活性成分；并通過動物的體內(nèi)藥理實驗評價活性成分對缺血心肌能量代謝方面的改善作用。
　　方法：<

2、br>　　首先，利用本實驗室前期構(gòu)建的β1-AR高表達的中國倉鼠卵巢S亞型（CHO-S）細胞，制備細胞膜色譜柱，建立β1AR/CMC-Offline-UPLC/MS分析方法；并通過比較美托洛爾（metoprolol）和地西泮（DZ）在該系統(tǒng)上的保留行為考察分析方法的可行性；分別制備吳茱萸95％乙醇、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷提取物，將以上提取物制備后，分別注入β1-AR/CMC色譜系統(tǒng)進行分析，收集β1-AR/CMC上的保留組分；在優(yōu)化

3、條件下將其注入UPLC/MS系統(tǒng)進行分析，對其中的活性成分進行鑒定。
　　其次，采用異丙腎上腺素（ISO）損傷β1-AR/CHO-S細胞；給予不同濃度的活性成分干預(yù)，觀察β1-AR激活后，其下游因子環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、蛋白激酶A（PKA）等表達水平的變化，評價活性成分對β1-AR的抑制作用。
　　最后，建立在體大鼠I/R損傷模型，采用股靜脈注射藥物進行干預(yù)，考察活性成分對I/R損傷大鼠能量代謝的改善作用。再灌注結(jié)束后，采

4、用Evans-Blue/TTC雙染法測定大鼠心肌梗死面積，依據(jù)試劑盒測定血清中葡萄糖、乳酸（LD）、游離脂肪酸（FFA）、乳酸脫氫酶（LDH）等能量代謝底物的變化，ELISA法測定心肌組織中ATP的含量、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）的含量以及Ca2+-ATPase的活性，初步評價活性成分對I/R大鼠心肌能量代謝的改善作用。
　　結(jié)果：
　　β1AR/CMC-Offline-UPLC/MS方法的可行性考察結(jié)果顯示

5、，β1AR/CMC-Offline-UPLC/MS系統(tǒng)專屬性地對β1-AR抑制劑metoprolol有強的選擇性（tR=7.3 min），且metoprolol在同一個高表達的β1-AR/CMC色譜柱上的保留時間（tR）的RSD為1.52%（n=6），在三個不同的高表達的β1-AR/CMC色譜柱上的保留時間（tR）的RSD為7.84%（n=3）。利用β1AR/CMC-Offline-UPLC/MS方法對95%乙醇、乙酸乙酯、石油醚、二氯

6、甲烷提取物進行篩選，結(jié)果顯示95%乙醇提取物中存在與β1-AR/CMC系統(tǒng)相互結(jié)合的活性成分，經(jīng) UPLC/MS鑒定為吳茱萸堿（Evo）和吳茱萸次堿（Rut）。
　　體外及體內(nèi)藥理實驗結(jié)果顯示：（i） Evo（1μM）和Rut（5μM）可以顯著降低ISO損傷β1-AR/CHO-S細胞的cAMP和PKA水平（P?0.01 vs ISO）；（ii）Evo（0.1 mg/kg）和Rut（0.1 mg/kg）可明顯減少心肌梗死面積；減少血

7、清FFA的含量，葡萄糖的含量及LD的含量，明顯升高心肌組織中ATP的含量，增強Ca2+-ATPase活性，抑制心肌組織中PPARα的生成。研究結(jié)果表明Evo和Rut能夠改善I/R損傷大鼠心肌對 FFA與葡萄糖的利用，改善了糖脂代謝的紊亂，提高了心肌能量的供應(yīng)，對I/R損傷心肌起到修復(fù)與能量改善作用。
　　結(jié)論：
　　本文所建立的β1AR/CMC-Offline-UPLC/MS分析方法具有靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性高、分析速度