IL-24原核和腺病毒表達(dá)載體構(gòu)建、活性檢測及AdIL-24蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、人白介素24(Interleukin 24，IL-24)是在人黑素瘤細(xì)胞終末分化時(shí)，通過eDNA文庫差減雜交時(shí)首先發(fā)現(xiàn)的，生化數(shù)據(jù)顯示該蛋白具有細(xì)胞因子活性，屬于IL-10基因超家族。研究顯示IL-24對多種腫瘤細(xì)胞具有特異性的抑制生長和誘導(dǎo)凋亡作用，同時(shí)又能刺激免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，因此成為腫瘤基因治療的熱點(diǎn)。為了進(jìn)一步探討IL-24對腫瘤細(xì)胞的作用及其可能的機(jī)制，本課題擬通過重組蛋白直接作用的方式或腺病毒轉(zhuǎn)入基因的方式，研究人I

2、L-24對人宮頸癌細(xì)胞株CaSki細(xì)胞的增殖和凋亡等的影響，并應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對AdIL-24的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。 第一部分　白介素24原核表達(dá)載體構(gòu)建及活性檢測 　　目的：克隆人IL-24基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，表達(dá)純化GST-IL-24融合蛋白，檢測其活性。 　　方法：用密執(zhí)毒素誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞表達(dá)IL-24 mRNA，通過RT-PCR獲取IL-24 cDNA，亞克隆入原核表達(dá)載體pGEX-4T-2，測序結(jié)果顯示在

3、IL-24 cDNA第223位G→A，370位T→C，從而導(dǎo)致其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸發(fā)生改變：A75T，H124Y，通過二次PCR將其糾正，重組載體pGEX-IL-24轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)GSTrapTMFF柱分離純化，SDS-PAGE和Westem blot鑒定融合蛋白表達(dá)。將CaSki細(xì)胞分為：PBS對照組、GST組、GST-IL-24組，通過MTT、流式檢測GST-IL

4、-24對宮頸癌CaSki細(xì)胞的作用。 　　結(jié)果：獲取人IL-24 cDNA，突變糾正后序列與GenBank公布序列(登錄號：NM_006850)完全一致，成功構(gòu)建pGEX-IL-24原核表達(dá)載體，0.1mmol/L IPTG可以有效地誘導(dǎo)融合蛋白GST-IL-24以町溶性形式表達(dá)，融合蛋白的分子量約為50kDa，可以顯著抑制CaSki增殖：終濃度5mg/L，10mg/L，25mg/L，50mg/L純化的GST-IL-24處理CaSki

5、細(xì)胞72h后，MTT檢測顯示它抑制率分別為：18.1％，29.1％，47.9％，56.1％，顯著高于相應(yīng)濃度的GST組，Annexin V流式細(xì)胞儀檢測GST-IL-24組早期凋亡率明顯高于其他各組(p＜0.01)。 　　結(jié)論：克隆得到人IL-24 cDNA，構(gòu)建其原核表達(dá)載體，表達(dá)純化得到GST-IL-24，該融合蛋白以劑量依賴的方式抑制CaSki細(xì)胞生長，促進(jìn)凋亡。 第二部分　白介素24腺病毒表達(dá)載體構(gòu)建及活性檢測 　　目的：

6、構(gòu)建人白介素24腺病毒載體，獲取病毒重組子，并研究其生物學(xué)活性。 　　方法：以pGST-IL-24為模板，通過PCR擴(kuò)增IL-24并將之克隆至pAdTrack-CMV載體，經(jīng)Pme I線性化后，與腺病毒骨架載體pAdEasy-1在BJ5183菌中同源重組，HEK 293細(xì)胞包裝擴(kuò)增，PCR、Western blot鑒定。AdIL-24處理宮頸癌CaSki細(xì)胞，通過MTT、細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)檢測其活性；Hoechst 33342染色、流式細(xì)胞

7、儀檢測凋亡。 　　結(jié)果：pAd-IL-24經(jīng)kpn I和Xho I酶切后可見9kb和650bp左右的條帶，證明構(gòu)建成功。重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)Pac I酶切后可見一條4.5kb和一條約30kb的條帶，表明同源重組成功。線性化同源重組的腺病毒，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，于熒光顯微鏡下可見綠色熒光表達(dá)，Western Blot檢測表明有目的蛋白表達(dá)。MTT結(jié)果顯示：AdIL-24以劑量依賴的方式明顯抑制CaSki細(xì)胞增殖。細(xì)胞存活分析實(shí)驗(yàn)表明可以明顯抑制

8、癌細(xì)胞的長期活力。Hoechst 33342染色結(jié)果顯示AdIL-24處理的CaSki細(xì)胞：核著色變深、固縮、碎裂、出現(xiàn)典型的凋亡小體，而對照組細(xì)胞形態(tài)學(xué)沒有明顯變化。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示： AdIL-24(100pfu/cell)處理CaSki細(xì)胞48h后，細(xì)胞凋亡率為33.58±3.31，相比Advec組(2.63±0.63)和PBS組(2.32±1.42)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。 　　結(jié)論：成功構(gòu)建人IL-24的重

9、組腺病毒載體，其病毒重組子具有生物活性。 第三部分　　AdIL-24抑癌機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 　　目的：利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法探討AdIL-24對宮頸癌CaSki細(xì)胞作用的分子機(jī)制。 　　方法：通過雙向凝膠電泳分離AdIL-24處理前后細(xì)胞總蛋白，并對膠條(pH3-10NL，pH4-7)、SDS-PAGE濃度(10％，12％)、電泳時(shí)間(6h，7h)進(jìn)行優(yōu)化，PDQuest圖像分析，MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定，MS-fit和Masco

10、t軟件查詢SWISS-PORT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，半定量RT-PCR檢測p53、BAX、AK1、GADD45γ、BCCIP、eIF-5A mRNA水平變化，Western blot在蛋白質(zhì)水平對p53、BAX進(jìn)行驗(yàn)證。 　　結(jié)果：獲得分辨率高、重復(fù)性好的CaSki細(xì)胞雙向電泳圖譜，圖像分析顯示有43個(gè)蛋白斑點(diǎn)表達(dá)有差異，經(jīng)MALDI-TOF檢測，鑒定T29個(gè)可能蛋白，1 5個(gè)上調(diào)表達(dá)(p53、BAX、AK1、GADD45γ、BCCIP等)，