沉默VEGF-C基因后膀胱癌T24細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)及maspin蛋白的表達(dá)和功能研究.pdf

1、第一部分沉默VEGF-C基因后膀胱癌T24細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 目的：尋找在膀胱癌T24細(xì)胞中與VEGF-C基因功能相關(guān)的蛋白，為了解VEGF-C基因在膀胱癌的作用機(jī)制提供新的思路。
　　 方法：采用RNA干擾技術(shù)沉默人膀胱癌T24細(xì)胞中的VEGF-C基因，再抽提沉默組和對(duì)照組的腫瘤細(xì)胞全蛋白，利用熒光差異顯示雙向凝膠電泳技術(shù)獲取蛋白質(zhì)電泳圖譜。通過對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)定量和鑒定，篩選出與VEGF-C基因可能有相互

2、作用的蛋白質(zhì)。
　　 結(jié)果：沉默組和對(duì)照組細(xì)胞之間存在25個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。經(jīng)質(zhì)譜鑒定后，23個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)被成功鑒定。這些蛋白質(zhì)包括:細(xì)胞骨架蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、分子伴侶、細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白、生物合成蛋白、能量代謝蛋白等。在這23個(gè)蛋白質(zhì)中，10個(gè)蛋白質(zhì)在沉默組中表達(dá)上調(diào)，另外13個(gè)蛋白質(zhì)沉默組中表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論：聯(lián)合應(yīng)用RNA干擾技術(shù)和比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法，高通量篩選膀胱癌細(xì)胞中VEGF-C功能相關(guān)蛋白具有可行性。

3、本研究發(fā)現(xiàn)了23個(gè)潛在的與VEGF-C功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步闡明VEGF-C促膀胱癌惡性發(fā)展的作用機(jī)制提供了新的線索和思路。
　　 第二部分maspin對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞生物學(xué)行為的影響和機(jī)制研究
　　 目的：研究maspin對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并初步探討其可能機(jī)制。
　　 方法：首先通過甲基化特異性PCR法檢測(cè)maspin啟動(dòng)子在膀胱癌T24細(xì)胞中的甲基化狀態(tài)，再利用RealTimePCR和

4、Westernblotting方法觀察不同濃度的5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR，0，0.25，0.5，1，2μmol/L)對(duì)maspin的mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。通過MTT實(shí)驗(yàn)觀察maspin對(duì)T24細(xì)胞的增殖能力的影響，通過流式細(xì)胞儀觀察maspin對(duì)T24細(xì)胞的凋亡的影響，通過遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察maspin對(duì)T24細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響，并通過Westernblo

5、tting方法檢測(cè)Bcl-2、Bax、caspase-3p17、CyclinD1、MMP-2、MMP-9和E-cadherin的蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：膀胱癌T24細(xì)胞可見maspin啟動(dòng)子甲基化DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。加入不同濃度的甲基化抑制劑5-Aza-CdR后，maspin的mRNA和蛋白表達(dá)水平均呈明顯增加，并具有濃度依賴性(P＜0.05);MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)T24細(xì)胞的增殖能力被明顯抑制(P＜0.05);流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)

6、現(xiàn)T24細(xì)胞的凋亡明顯增加(P＜0.05);細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)表明T24細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯減弱(P＜0.05)。Westernblotting的結(jié)果顯示CyclinD1、Bcl-2、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)水平顯著下降，而Bax、caspase-3p17和E-cadherin的水平則顯著增高(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：膀胱癌T24細(xì)胞maspin基因的啟動(dòng)子存在高甲基化狀態(tài)。采用甲基化抑制劑5-Aza-Cd

7、R處理后，maspin的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯增加。maspin通過下調(diào)cyclinD1的表達(dá)，抑制T24細(xì)胞的增殖;通過上調(diào)促凋亡蛋白Bax和caspase-3p17的表達(dá)以及下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)T24細(xì)胞的凋亡;通過下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)以及上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，抑制T24細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　 第三部分maspin與VEGF-C在膀胱癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究
　　 目的

8、：研究膀胱癌標(biāo)本中maspin蛋白與VEGF-C蛋白表達(dá)的關(guān)系，并通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　 方法：采用免疫組化的方法研究53例膀胱癌患者的手術(shù)標(biāo)本中VEGF-C蛋白和maspin蛋白的表達(dá)情況，并檢驗(yàn)兩者的相關(guān)性。采用Westernblotting方法檢測(cè)不同濃度的VEGF-C(0，50，100，200ng/mL)對(duì)maspin蛋白在T24細(xì)胞中的表達(dá)的影響。通過不同濃度的5-Aza-CdR（0，0.25，0.5，1，2μ

9、mol/L）激活maspin的表達(dá)，再采用Westernblotting方法觀察maspin對(duì)T24細(xì)胞中VEGF-C蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)探討其相關(guān)性。
　　 結(jié)果：VEGF-C蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織，而maspin蛋白的表達(dá)在膀胱癌組織中的表達(dá)則顯著低于正常組織。53例膀胱癌標(biāo)本的maspin蛋白與VEGF-C蛋白表達(dá)都與膀胱癌的臨床分期、病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.05)，與性別、年齡、腫

10、瘤大小、腫瘤個(gè)數(shù)和發(fā)病次數(shù)均無明顯相關(guān)(P＞0.05)。maspin的表達(dá)與VEGF-C的表達(dá)呈負(fù)性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.589(P＜0.001)。VEGF-C作用于T24細(xì)胞后，maspin蛋白的表達(dá)明顯下降;而當(dāng)maspin蛋白的表達(dá)被激活后，VEGF-C蛋白的表達(dá)也顯著減少。這兩種效應(yīng)均具有濃度依賴性(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：VEGF-C蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)顯著高于正常膀胱組織，而maspin蛋白在膀胱癌組織中的