FGFR3在PTH1-34促骨合成代謝中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、骨骼是機(jī)體最大的器官，具有支撐機(jī)體、協(xié)助運(yùn)動、保護(hù)內(nèi)臟器官等重要功能，并在調(diào)節(jié)機(jī)體鈣、磷、鎂等離子平衡中起關(guān)鍵作用。骨骼一直處于新陳代謝狀態(tài)，從而維持骨強(qiáng)度和骨完整性。骨重建過程是指成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收之間的動態(tài)平衡過程。骨穩(wěn)態(tài)一旦被破壞，將導(dǎo)致骨質(zhì)量和骨密度(Bone MineralDensity，BMD)的改變。如果骨吸收強(qiáng)于骨形成，骨骼將會發(fā)生骨質(zhì)疏松(Osteoporosis)。
　　 骨質(zhì)疏松是以

2、骨量降低和骨組織的微結(jié)構(gòu)退化為特征，導(dǎo)致骨脆性增加、骨強(qiáng)度降低而易骨折的一種全身系統(tǒng)性疾病，嚴(yán)重影響中老年人的生活質(zhì)量和健康。隨著人口的老齡化，骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為全球性的健康問題。
　　 目前治療骨質(zhì)疏松的藥物主要包括抗骨吸收類(如雌激素、降鈣素以及雙膦酸鹽等)、促骨形成類(如PTH1-34等)以及同時具有促進(jìn)成骨、抑制破骨的雙功能藥物(如中藥、鍶鹽等)?？构俏疹愃庪m能抑制骨吸收、減少骨量丟失，但是骨轉(zhuǎn)換率的降低使骨微損傷得不到

3、及時清除，可能導(dǎo)致骨骼脆性增加。促骨合成類藥物可避免上述缺陷。甲狀旁腺激素1-34(Parathroid hormone, PTH)是迄今為止FDA 批準(zhǔn)的治療骨質(zhì)疏松的唯一促骨合成類藥(即特里帕肽，tetroparatide)。PTH1-34 主要通過增加成骨細(xì)胞數(shù)量和活性來促進(jìn)骨形成，最終使骨量增加并改善骨質(zhì)量。
　　 PTH是由甲狀旁腺主細(xì)胞分泌，主要作用于骨骼和腎臟。成熟的PTH 由84個氨基酸殘基組成，其生物活性主要決

4、定于N 端的1～34 位氨基酸序列，目前臨床上使用的是其1-34 片段，即PTH1-34。PTH1-34對骨骼的作用效果與劑量和用藥方式有關(guān)。
　　 大劑量連續(xù)PTH1-34 治療增加破骨細(xì)胞活性促進(jìn)骨吸收，使骨量降低。低劑量間斷PTH1-34 處理主要增加成骨細(xì)胞活性促進(jìn)骨形成，使骨量增加。研究表明間斷PTH 處理可以通過多種機(jī)制促進(jìn)骨形成：(1)促進(jìn)前成骨細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞；(2)抑制脂肪細(xì)胞的生成；(3)使骨襯細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成

5、骨細(xì)胞；(4)抑制成骨細(xì)胞的凋亡；(5)通過一些自分泌/旁分泌的分子間接發(fā)揮作用，如：TGF-β、IGF-1、Wnt、FGF等，但是其潛在的分子機(jī)制尚不完全清楚，有待進(jìn)一步深入研究。
　　 成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)及其受體成纖維細(xì)胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor, FGFR)在骨骼生長發(fā)育和成年后骨穩(wěn)態(tài)的維持中具有重要作用。

6、FGF2 敲除小鼠骨形成降低導(dǎo)致骨小梁骨體積減少。FGF18 敲除小鼠生長板軟骨細(xì)胞增殖帶和肥大帶增寬，長骨骨化延遲，骨橋素(osteopotin, OP)、骨鈣素(osteocalcin, OC)等成骨細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)下降。FGF23 敲除小鼠血清鈣、磷含量和1,25(OH)2D水平升高并伴發(fā)骨質(zhì)疏松癥狀。除FGF 外，F(xiàn)GF的受體即FGFR在骨骼系統(tǒng)中的作用亦有較多研究報道。FGFR1和FGFR2 敲除小鼠胚胎期死亡，而FGFR1及

7、FGFR2的激活突變主要影響顱面部骨骼的發(fā)育，導(dǎo)致各種顱縫早閉綜合征，如Pfeffer 綜合征、Jackson-Weiss 綜合征、crouse 綜合征或者Apert 綜合征等。FGFR3是骨骼生長的負(fù)性調(diào)控分子，其組成激活性突變可以引起軟骨發(fā)育不全(achondroplasia,ACH)、軟骨發(fā)育不良(hypochondroplasia, HCH)以及致死性軟骨發(fā)育不全(thanatoplasiadysplasia, TD)等。而FG

8、FR3 敲除小鼠表現(xiàn)為骨骼過度生長、骨量減少、骨骼礦化障礙，但是其成骨細(xì)胞數(shù)量和活性均增加。
　　 Hurley等發(fā)現(xiàn)間斷PTH1-34 處理不能增加FGF2 敲除小鼠的BMD和骨量，并且FGF2 敲除阻斷了PTH1-34 促進(jìn)成骨細(xì)胞發(fā)生、增殖、分化以及抗凋亡的作用，表明內(nèi)源性FGF2在很大程度上介導(dǎo)了PTH的促骨合成代謝，F(xiàn)GF2 敲除抑制了PTH 促進(jìn)骨形成的作用。FGF的作用要經(jīng)其受體即FGFR 來發(fā)揮，F(xiàn)GF2 可激活

9、FGFR1、2、3、4，提示FGFR 也可能與PTH1-34的促進(jìn)成骨活性有關(guān)。事實(shí)上，Hurley等發(fā)現(xiàn)PTH1-34處理可以增加FGF2、FGFR1以及FGFR2的表達(dá)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)PTH1-34 可以降低成骨細(xì)胞中FGFR3的表達(dá)。此前已發(fā)現(xiàn)FGFR3 可抑制成骨細(xì)胞的早期分化和胞外基質(zhì)合成。因此，我們推測PTH 促進(jìn)骨形成與FGFR3的表達(dá)下調(diào)相關(guān)，換言之，抑制FGFR3 可能增強(qiáng)PTH 促進(jìn)骨形成、治療骨質(zhì)疏松的功效。因此

10、，本研究我們首先考察了間斷PTH1-34 處理對FGFR3 敲除的成骨細(xì)胞活性的影響，并給于PTH1-34間斷處理FGFR3 敲除小鼠，綜合運(yùn)用影像學(xué)、組織學(xué)、細(xì)胞和分子生物學(xué)手段來研究FGFR3在PTH 促進(jìn)骨形成中的作用，并分析其可能的機(jī)制。
　　 我們從美國NIH 鄧初夏教授引進(jìn)FGFR3+/-小鼠(C3H 背景)，通過FGFR3+/-×
　　 FGFR3+/-交配得到FGFR3 敲除(KO)及同窩野生型(WT)小

11、鼠。分離培養(yǎng)原代顱骨成骨細(xì)胞(calvariAlosteoblast cells, COBs)和骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromAlcells,BMSCs)，用10nM PTH1-34 或者Vehicle 間斷處理(WT 處理組(WT+)、WT對照組(WT-)、KO 處理組(KO+)、KO對照組(KO-))，MTT 檢測細(xì)胞增生，結(jié)果顯示KO+組細(xì)胞數(shù)量為各組中最多，WT+組細(xì)胞數(shù)量也增加；原代細(xì)胞經(jīng)過成骨誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)及

12、間斷PTH1-34 處理后，兩種基因型的成骨細(xì)胞ALP 活性均增加，定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)PTH1-34處理后成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因(Cbfa1，OC，OP)的表達(dá)在KO 成骨細(xì)胞中增加較WT成骨細(xì)胞更明顯；茜素紅染色發(fā)現(xiàn)PTH1-34 處理后KO小鼠成骨細(xì)胞礦化能力得到部分恢復(fù)。此外，TRAP 染色發(fā)現(xiàn)PTH1-34 間斷處理后，WT+和KO+小鼠破骨細(xì)胞的數(shù)量均顯著增加。定量PCR 檢測發(fā)現(xiàn)PTH1-34 處理后RANKL/OPG的比值在

13、KO小鼠中的增加幅度更大。上述結(jié)果提示PTH1-34 處理能夠增加WT和KO小鼠成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性，并且FGFR3的敲除放大了PTH的促進(jìn)作用。我們進(jìn)一步在小鼠體內(nèi)觀察FGFR3 敲除對PTH 促進(jìn)骨形成的影響。分別對2月齡和4月齡的雄性WT和KO小鼠腹腔給予PTH1-34 (80ug/kg/day)或者同等體積的生理鹽水，間斷處理28天。
　　 給藥結(jié)束后取右側(cè)股骨進(jìn)行X 光攝影以及BMD 檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WT+和KO+小

14、鼠股骨的骨量及骨小梁BMD 明顯升高，但是在兩種基因型中增加幅度沒有顯著差別，而PTH1-34 處理后骨皮質(zhì)BMD 增加幅度在KO小鼠中明顯高于WT小鼠；我們進(jìn)一步用Micro-CT對小鼠股骨進(jìn)行了掃描和三維重建，股骨的縱向二維掃描圖顯示PTH能增加WT和KO小鼠骨小梁數(shù)量，骨形態(tài)參數(shù)定量分析結(jié)果顯示PTH 處理后WT和KO小鼠BV/TV、Tb.Th 以及Tb.N 均增加，而Tb.Sp和SMI 均降低；橫斷面掃描顯示PTH 處理增加WT

15、和KO小鼠骨皮質(zhì)厚度，并且KO小鼠增加幅度明顯高于WT小鼠；
　　 脛骨HE 染色顯示PTH 處理后WT和KO小鼠骨小梁數(shù)量增多、厚度增加，并且KO小鼠脛骨骨皮質(zhì)厚度增加更顯著。TRAP 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)WT+和KO+小鼠TRAP 陽性信號增多，表明PTH 處理后WT和KO小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量增加；組織定量PCR 結(jié)果顯示PTH 處理后KO小鼠成骨細(xì)胞(Cbfa1, OC, OP, COL1)和破骨細(xì)胞(MMP9, Trap)分化標(biāo)志基

16、因表達(dá)與WT小鼠相比增加幅度更顯著。我們的上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PTH1-34 間斷給藥能增加野生和FGFR3 敲除小鼠股骨的骨量和骨密度(BMD)，雖然KO小鼠骨小梁骨體積(BV/TV)及BMD的增加幅度與WT小鼠相比沒有顯著差異，但是骨皮質(zhì)的BMD和厚度較WT小鼠增加更顯著，提示抑制FGFR3 可增強(qiáng)PTH1-34 間斷給藥對骨皮質(zhì)的合成作用。
　　 綜上所述，本研究中我們發(fā)現(xiàn)PTH1-34 間斷處理能抑制成骨細(xì)胞中FGFR3的表

17、達(dá)，F(xiàn)GFR3 敲除能增強(qiáng)PTH1-34對成骨細(xì)胞早期分化及基質(zhì)合成的促進(jìn)作用。在小鼠體內(nèi)間斷給予PTH1-34 處理的情況下，F(xiàn)GFR3 敲除小鼠骨皮質(zhì)BMD和厚度的增加幅度較WT小鼠更明顯，但其骨小梁BV/TV 以及BMD 增加幅度與野生型相比沒有顯著差別。FGFR3 敲除小鼠骨組織中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因在PTH1-34 處理后的增加幅度均較野生型明顯。我們的研究結(jié)果提示：抑制FGFR3的表達(dá)可能有助于增強(qiáng)PTH的促骨合成