高遷移率族蛋白1(HMGB1)和姜黃素對(duì)內(nèi)皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：心力衰竭嚴(yán)重危害著人類的健康，心肌纖維化是終末期心力衰竭的共同病理特點(diǎn)，心肌纖維化已成為心力衰竭治療的重要靶點(diǎn)。異常內(nèi)皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(Endothelial-mesenchymal transition，EndMT)是心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制之一，因此通過(guò)深入研究EndMT的機(jī)制并探索延緩甚至逆轉(zhuǎn)EndMT的有效藥物，可能為防治心力衰竭提供潛在的新型治療藥物。脂多糖可激活TLR4誘導(dǎo)EndMT促進(jìn)纖維化發(fā)展。高遷移率族蛋白1

2、(high mobility group box-1protein，HMGB1)是TLR4的配體，且研究證明HMGB1通過(guò)TGF-β1/Smad2/3通路誘導(dǎo)EMT促進(jìn)肺纖維化。雖沒(méi)有直接證據(jù)表明HMGB1通過(guò)TGF-β1/Smad2/3通路誘導(dǎo)EndMT，但EndMT是EMT的特殊類型，因此，同樣作為TLR4配體的HMGB1可能通過(guò)TLR4/NF-κB/TGF-β1/Smad2/3通路誘導(dǎo)EndMT促進(jìn)心肌纖維化。研究表明姜黃素具有抗

3、纖維化的作用，但姜黃素是否能夠通過(guò)抑制EndMT抗心肌纖維化尚不明確。
　　方法：分三部分:(1)查閱文獻(xiàn)初定候選濃度梯度，CCK8和Western blot確定姜黃素、AngⅡ、HMGB1藥物作用濃度。(2)初步探索姜黃素對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)EndMT的影響及其機(jī)制;分組:1.對(duì)照組;2.AngⅡ組;3.姜黃素+AngⅡ組;4.氯沙坦+AngⅡ組;顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組遷移能力;Western blot檢測(cè)各組VE-

4、cadherin，α-SMA，TGF-β1表達(dá)。(3)進(jìn)一步研究姜黃素對(duì)HMGB1誘導(dǎo)EndMT的影響及其機(jī)制:分組:1.對(duì)照組;2.HMGB1組;3.姜黃素+HMGB1組;4.CLI-095+HMGB1組;5.CLI-095（TLR4特異性抑制劑）組;各組作用5天顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化;各組作用24小時(shí)，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組遷移能力，RT-QPCR檢測(cè)各組VE-cadherin，α-SMA，TGF-β1，collagenⅠ和collage

5、nⅢ的mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)各組VE-cadherin，α-SMA，TLR4，TGF-β1，collagenⅠ，Phospho-NF-κB p65，Phospho-Smad2/3蛋白表達(dá)差異;免疫熒光顯示各組VE-cadherin，α-SMA表達(dá)情況。
　　結(jié)果：第一部分初篩作用濃度姜黃素為12.SμM，AngⅡ?yàn)?μM，HMGB1為800ng/ml。第二部分(1)HUVECs經(jīng)AngⅡ刺激形態(tài)改變，長(zhǎng)梭形樣細(xì)

6、胞增多;姜黃素和氯沙坦可維持內(nèi)皮細(xì)胞鋪路石樣形態(tài)。(2)相比對(duì)照組，AngⅡ促進(jìn)HUVECs的遷移(P＜0.05);相對(duì)AngⅡ組，加入姜黃素和氯沙坦抑制HUVECs的遷移（P＜均0.05）;(3)AngⅡ可誘導(dǎo)EndMT，AngⅡ刺激后VE-cadherin表達(dá)減弱(P=0.003)，而α-SMA和TGF-β1的表達(dá)都明顯增強(qiáng)（P均＜0.01），姜黃素和氯沙坦使VE-cadherin表達(dá)明顯增加，而α-SMA和TGF-β1的表達(dá)均明顯

7、下調(diào)。第三部分(1)HUVECs經(jīng)HMGB1刺激后可見(jiàn)長(zhǎng)梭形樣細(xì)胞增多;姜黃素和TLR4特異性抑制劑CLI-095可維持內(nèi)皮細(xì)胞鋪路石樣形態(tài)。(2)與對(duì)照組相比，HMGB1促進(jìn)HUVECs的遷移(P＜0.05);相對(duì)HMGB1組，加入姜黃素和CLI-095抑制HUVECs的遷移（P＜均0.05）;(3)RT-QPCR結(jié)果:相比對(duì)照組，HMGB1組VE-cadherin mRNA表達(dá)減弱(P＜0.05)，而α-SMA，collagenⅠ，

8、collagenⅢ和TGF-β1的mRNA表達(dá)均明顯升高（P均＜0.01）;與HMGB1組相比，姜黃素+HMGB1組和CLI-095+HMGB1組的VE-cadherinmRNA表達(dá)明顯增加（P均＜0.05），而α-SMA，collagenⅠ和TGF-β1的mRNA表達(dá)均降低（P均＜0.05）;(4)Western blot結(jié)果:與對(duì)照組相比，HMGB1刺激后VE-cadherin蛋白表達(dá)減弱(P＜0.05)，而α-SMA，collag

9、enⅠ，Phospho-NF-κB，TGF-β1和Phospho-Smad2/3的蛋白表達(dá)都升高（P均＜0.01）;與HMGB1組相比，姜黃素+HMGB1組和CLI-095+HMGB1組的VE-cadherin表達(dá)明顯增加（P均＜0.05），而α-SMA，collagenⅠ，Phospho-NF-κB,TGF-β1和Phospho-Smad2/3的蛋白表達(dá)均降低（P均＜0.05）;(5)免疫熒光顯示:HMGB1組VE-cadherin蛋

10、白（紅色）熒光明顯減弱，而α-SMA蛋白（綠色）熒光表達(dá)都增強(qiáng);與HMGB1組相比，姜黃素和CLI-095使VE-cadherin（紅色）熒光增加，而α-SMA綠色熒光顯示不明顯。
　　結(jié)論：1.姜黃素通過(guò)下調(diào)TGF-β1表達(dá)抑制由AngⅡ誘導(dǎo)的EndMT。
　　2.HMGB1通過(guò)激活TLR4/NF-κB/TGF-β1/Smad2/3信號(hào)通路誘導(dǎo)EndMT，促進(jìn)膠原蛋白的分泌。
　　3.姜黃素和CLI-095可通過(guò)下調(diào)