豬IFITM3基因Piggybac載體構建及其在PK15細胞中的表達.pdf

1、干擾素是種具有抗病毒、抑制細胞分裂、調節(jié)免疫和促進細胞凋亡等多種生物學活性的細胞因子，干擾素通過與其受體結合，誘導細胞內干擾素刺激基因(Interferon Stimulated Genes,ISGs)產生，表達相應的蛋白質從而完成多種生物學功能。干擾素誘導的跨膜蛋白3(Interferon-induced transmembrane protein3，IFITM3)基因是一種重要的干擾素刺激基因。IFITM3具有調節(jié)細胞生長分化、細胞

2、增殖和抵御病毒入侵等多種生物學功能。目前對于IFITM3基因的研究主要集中在人和鼠方面，著重于IFITM3基因在腫瘤組織和癌細胞中表達豐度的變化。有關豬IFITM3基因的研究集中在其抗病毒作用方面，具體機制尚不清楚。PiggyBac(PB)轉座子能快速高效地將目的基因插入真核細胞基因組中，為在細胞中評價目的基因的功能提供了便利。
　　本文旨在構建豬IFITM3基因的PB轉座子重組載體，并初步在PK15細胞中對其表達進行評價，為進一

3、步研究該基因在細胞水平的抗病毒機制奠定前期實驗基礎。利用RT-PCR方法從豬脾臟組織中對IFITM3基因ORF區(qū)進行克降，分析IFITM3基因在豬各組織中的表達，以pET-21b(+)為骨架構建原核重組表達載體，利用SDS-PAGE和Western Blot分析IFITM3基因在大腸桿菌中的融合表達，用PB轉座子構建真核重組表達載體PB-IFITM3，將IFITM3基因轉染整合到PK15細胞基因組中，QRT-PCR方法檢測IFITM3等

4、基因在PK15細胞中的mRNA表達水平，評價IFITM3基因過表達對LPS介導的炎性信號分子表達的影響。結果顯示:克隆的豬IFITM3基因長度為438 bp，編碼145個氨基酸;IFITM3基因在豬脾臟和肺臟中表達豐度較高;原核表達載體所表達的蛋白大小為22.3ku，其中部分為可溶性蛋白，另一部分以包涵體形式存在;構建了PB-IFITM3真核重組表達載體，實現了IFITM3基因在PK15細胞中的過表達;QRT-PCR結果顯示:IFITM