外源基因在轉(zhuǎn)基因741楊雜交子代中的遺傳和表達(dá)研究.pdf

1、楊樹生長(zhǎng)迅速,是我國(guó)重要的生態(tài)和工業(yè)用材樹種?；蚬こ痰陌l(fā)展為楊樹品種的遺傳改良提供了新的技術(shù)方法,2002年轉(zhuǎn)基因741楊獲得林業(yè)生物基因工程安全委員會(huì)批準(zhǔn)的商品化許可證書。楊樹生命周期長(zhǎng),外源基因能否多年穩(wěn)定表達(dá)并能遺傳,成為影響轉(zhuǎn)基因楊樹栽培或作為楊樹育種種質(zhì)應(yīng)用的重要因素。本文以大田栽植5年以上的轉(zhuǎn)基因741楊和轉(zhuǎn)基因三倍體毛白楊為試驗(yàn)材料,研究了外源基因在楊樹基因組中的表達(dá)、整合位置、遺傳規(guī)律以及對(duì)受體植株生長(zhǎng)的影響等,并對(duì)轉(zhuǎn)

2、基因74l楊作為育種種質(zhì)進(jìn)行了探討,主要結(jié)果如下:
　　 1.對(duì)10a生轉(zhuǎn)基因741楊基因組中BtCryIAc基因和NptⅡ基因的PCR檢測(cè)表明,外源基因均穩(wěn)定存在,未發(fā)現(xiàn)外源基因丟失現(xiàn)象。室內(nèi)飼蟲試驗(yàn)證明,轉(zhuǎn)基因741楊各無性系對(duì)楊扇舟蛾和美國(guó)白蛾具有持續(xù)穩(wěn)定的抗性,其高抗蟲株系pb29和pb11對(duì)楊扇舟蛾1齡初孵幼蟲的殺蟲效果持續(xù)在85％～95%之間,對(duì)美國(guó)白蛾則基本在95%以上。未表現(xiàn)出有規(guī)律下降的趨勢(shì)。
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3、.經(jīng)過2年的調(diào)查發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因741楊無性系pb11與受體741楊在進(jìn)入開花年齡,以及果穗數(shù)量、長(zhǎng)度、粗度以及每穗蒴果數(shù)、果穗脫落、自然結(jié)實(shí)率等方面均未表現(xiàn)出明顯差異。數(shù)據(jù)表明,741楊與轉(zhuǎn)基因741楊均高度不育,自然結(jié)實(shí)率低于3%。對(duì)試驗(yàn)林的生長(zhǎng)調(diào)查表明,大汲店9a生轉(zhuǎn)基因741楊無性系與易縣毛白楊在高生長(zhǎng)上差異不顯著;pb17胸徑生長(zhǎng)量、材積生長(zhǎng)量明顯好于pb29和pb11。涿州7a生轉(zhuǎn)基因741楊pb29與741楊在樹高、胸徑和材積

4、生長(zhǎng)上均無顯著差異。
　　 3.以轉(zhuǎn)基因741楊為母本,84K楊為父本進(jìn)行切枝雜交,結(jié)果表明:84K楊的花粉生命力在不同年份存在較大差異,簡(jiǎn)單的干燥處理和4℃低溫保存僅能維持其生活力2～3d。轉(zhuǎn)基因741楊的結(jié)實(shí)率在各無性系間差異顯著,最高僅為11.8%。F1代種子萌發(fā)率和實(shí)際成苗率最高分別為18.5%和32.7%。通過胚培養(yǎng),可提高F1代獲得率,其最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA0.1mg/L+IAA0.01mg/L+3%蔗糖,胚齡

5、越長(zhǎng)萌發(fā)率越高。雜交子代未能表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢(shì),生長(zhǎng)弱于雙親,5年保存率為15.7%。
　　 4.對(duì)F1代中的BtCryIAc基因和NptⅡ基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明:在雜交組合pb1x84K、pb11x84K和pb29x84K的F1代中,BtCryIAc基因PCR陽性植株與陰性植株的比例分別為1.31、1.15和0.86,經(jīng)X2檢驗(yàn)BtCryIAc基因符合由一對(duì)等位基因控制的1:1的孟德爾自由分離規(guī)律;NptⅡ基因也表現(xiàn)出同樣的

6、1:1的孟德爾遺傳分離規(guī)律。pb6×84K的F1代中,外源BtCryIAc基因和NptⅡ基因的分離比,符合外源基因雙位點(diǎn)插入時(shí)3:1的分離規(guī)律。BtCryIAc基因和NptⅡ基因在轉(zhuǎn)基因741楊雜交后代中呈現(xiàn)緊密的連鎖關(guān)系。
　　 5.雜交子代在含卡那霉素的生根培養(yǎng)基上的篩選結(jié)果表明:pb1×84K雜交組合卡那霉素抗性株系:非抗株系符合1:1的分離規(guī)律;pb6×84K雜交組合符合3:1的分離規(guī)律。說明NptⅡ基因在轉(zhuǎn)基因741楊

7、雜交子代中可穩(wěn)定表達(dá),并且其遺傳符合顯性基因控制的孟德爾遺傳?？敲顾乜剐栽陔s交子代株系間存在差異。pb6×84K子代中有1個(gè)株系,NptⅡ基因PCR結(jié)果呈陽性,但未表達(dá)卡那霉素抗性,呈現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象。
　　 6.利用流式細(xì)胞儀(PA)對(duì)轉(zhuǎn)基因741楊(三倍體)及其雜交子代進(jìn)行了染色體倍性檢驗(yàn)。結(jié)果表明,在檢測(cè)的18個(gè)F1代中,三倍體有4個(gè),混倍體或近似三倍體有9個(gè),二倍體有5個(gè),其比例接近1:2:1。
　　 7.用轉(zhuǎn)基

8、因741楊雜交F1代中含有BtCryIAc基因的株系,室內(nèi)飼養(yǎng)楊扇舟蛾和美國(guó)白蛾,結(jié)果表明:轉(zhuǎn)基因雜交后代可穩(wěn)定獲得其母本的抗蟲基因,并能夠穩(wěn)定表達(dá)抗蟲性,不僅可以使低齡幼蟲致死,還可明顯延緩幼蟲的發(fā)育,并影響其正?；肌Ｕf明BtCryIAc基因?yàn)槊系聽栵@性遺傳,抗蟲性強(qiáng)的親本,子代抗性也強(qiáng),不抗蟲的親本產(chǎn)生的子代仍不具備抗蟲性。但在同一家系中,不同子代間抗蟲性存在差異。對(duì)轉(zhuǎn)雙抗蟲基因741楊雜交后代不同家系進(jìn)行Bt毒蛋白表達(dá)檢測(cè),也展