MicroRNA-34a對(duì)心肌細(xì)胞SH2B3表達(dá)的調(diào)控作用.pdf

1、心肌纖維化嚴(yán)重影響心臟的正常功能，在外界因素刺激下，細(xì)胞外基質(zhì)中成分的異常是導(dǎo)致纖維化的最主要因素，而延緩或阻止纖維化的發(fā)生和進(jìn)展可明顯改善心肌功能。隨著研究的不斷深入，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞活性來(lái)影響心肌纖維化已成為治療該類疾病的主要目標(biāo)。因此，了解心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制及調(diào)節(jié)途徑顯得非常重要。當(dāng)心肌細(xì)胞接受外界不良刺激后，會(huì)通過(guò)一系列步驟將信號(hào)傳導(dǎo)入心肌細(xì)胞內(nèi)部，從而影響細(xì)胞的功能和活性。
　　SH2B3屬于SH2B接頭蛋白家族成員之一，

2、影響細(xì)胞內(nèi)分子的定位，可影響許多由Janus激酶和受體酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號(hào)通路活性。研究表明，SH2B3參與造血細(xì)胞的分化，并與心肌梗死、代謝綜合征、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病關(guān)系相當(dāng)密切。在小鼠心肌梗死模型中，敲除了SH2B3表達(dá)后，其纖維化程度隨之升高，在當(dāng)前的研究成果中，已提示在心肌梗死后纖維化過(guò)程中SH2B3發(fā)揮了一定的作用，但到目前為止，關(guān)于該分子在心肌纖維化過(guò)程中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制還不清楚。microR

3、NA(miRNA)是一類含21-25個(gè)堿基的非編碼單鏈核苷酸，近年來(lái)被認(rèn)為是一種新的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)子，可通過(guò)與靶基因的3'非翻譯區(qū)(3' untranslated region，3'UTR)相互作用來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，最終影響細(xì)胞活性。該分子的作用特點(diǎn)是同一miRNA可對(duì)多個(gè)靶基因進(jìn)行同時(shí)調(diào)控。
　　越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA在心血管疾病，特別是心肌纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。最新有關(guān)研究已表明，在心肌梗死模型中miR-34a參與了

4、心肌細(xì)胞收縮功能的調(diào)控，抑制其表達(dá)可提高心肌的收縮功能。目前Flister等研究均已發(fā)現(xiàn)，miR-34a通過(guò)靶向調(diào)控Smad4、促進(jìn)分泌纖維化相關(guān)膠原，使其在心肌梗死后纖維化區(qū)域中的表達(dá)顯然上調(diào)，并最終影響了心肌纖維化過(guò)程。
　　目的：
　　(1)觀察轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1對(duì)miR-34a和SH2B3表達(dá)的作用;
　　(2)明確miR-34a對(duì)SH2B3的調(diào)控作用。
　　方法：
　　為了證明miR-34a可能調(diào)

5、控SH2B3的表達(dá)，本課題首先體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞，分別在接受轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1和缺氧處理后，提取總蛋白和RNA后，采用Western blot和qRT-PCR法檢測(cè)SH2B3在蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)量變化;采用qRT-PCR法檢測(cè)接受以上刺激后，miR-34a的表達(dá);在心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-34a mimics和miR-34a inhibitor后，采用Western blot和qRT-PCR法檢測(cè)SH2B3在蛋白水平和mRNA水平

6、的表達(dá)量變化;構(gòu)建針對(duì)miR-34a作用位點(diǎn)的SH2B3熒光素酶報(bào)告基因載體，采用熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)miR-34a對(duì)SH2B3基因3' UTR區(qū)活性的影響。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞作用過(guò)程中，SH2B3在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均降低;miR-34a的表達(dá)水平升高;α-SMA蛋白的表達(dá)升高。Western blot和qRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物后，SH2B3的表達(dá)

7、降低;轉(zhuǎn)染miR-34a抑制物后SH2B3的表達(dá)升高。熒光素酶報(bào)告檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-34a可通過(guò)影響SH2B33'UTR活性，調(diào)控其表達(dá)。另外，在心肌細(xì)胞接受缺氧刺激后，SH2B3的表達(dá)量隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，miR-34a的表達(dá)則升高，這種表達(dá)的相反趨勢(shì)進(jìn)一步證明兩者的相互調(diào)控關(guān)系。
　　結(jié)論：
　　1.發(fā)現(xiàn)miR-34a可作用于SH2B3的3'UTR區(qū)，從而調(diào)控其在心肌細(xì)胞中的表達(dá)。
　　2.在TGF-β1及缺