大白菜BrCYP79B2-B3啟動子克隆及特異性分析.pdf

1、大白菜（Brassica rapa ssp.pekinensis）是十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica）葉用蔬菜。硫代葡萄糖苷（Glucosinolates，GS，簡稱硫苷），是一種在十字花科植物中廣泛存在的植物次生代謝產(chǎn)物，具有多種不同功能。本實驗通過克隆大白菜‘chiifu’中的BrCYP79B2(BrCYP79B2-1、BrCYP79B2-2、BrCYP79B2-3)和BrCYP79B3啟動子，構(gòu)建GUS表達(dá)

2、載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，分析它們的表達(dá)水平差異，為研究這些基因在吲哚族硫苷合成途徑中的功能分化奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)根據(jù)Brassica Database和BrGDB Query確定BrCYP79B2（BrCYP79B2-1、BrCYP79B2-2、BrCYP79B2-3）和BrCYP79B3啟動子的長度與位置，用軟件PrimerPremier5設(shè)計特異引物。
　　(2)克隆BrCYP79B2(BrCYP79B2

3、-1、BrCYP79B2-2、BrCYP79B2-3)和BrCYP79B3啟動子。分析這些啟動子序列元件，發(fā)現(xiàn)它們不僅含有TATA-box和GATAbox等啟動子核心元件，還具有多個特異元件，如光誘導(dǎo)元件AE-box、激素響應(yīng)元件CGTCA-motif、參與防御應(yīng)急機(jī)制元件MBS等。
　　(3)構(gòu)建了帶有GUS報告基因的植物表達(dá)載體pBI-B2-1、pBI-B2-3、pBI-B3,采用花序侵染法將其轉(zhuǎn)化到擬南芥野生型Columbi

4、a中。利用GUS組織化學(xué)染色的方法，對T2代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分析，分析其在不同時期、不同組織部位的表達(dá)模式。
　　(4)通過水處理3h、干旱處理2h、200μM乙烯處理2.5 h和25μM、50μM、100μM生長素(IAA)處理3h等方法，對ProB2-1:GUS和ProB2-3:GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行處理，經(jīng)過GUS組織化學(xué)染色法，發(fā)現(xiàn)，ProB2-1:GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥在水處理時在根尖處有所表達(dá)，干旱處理時整個根部都明顯表達(dá)，

5、乙烯處理時，在子葉和胚軸下端不表達(dá)，生長素處理時根部變化較大，特別是根尖，隨著濃度提高，在根中表達(dá)變少，25μM時表達(dá)最多，但在根尖中一直都表達(dá)。與對照相比，ProB2-3:GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥，只有在乙烯處理時變化最大，此時整個植株都不表達(dá)。
　　(5)采用熒光定量的方法，分析200μmol/L NaCl、200μmol/L茉莉酸甲酯(MeJA)、1.5μmol/L犬尿氨酸(Kyn)和200μmol/L氨基氧乙酸(AOA)處理對轉(zhuǎn)