針刺俞募穴改善FC小鼠胃腸傳輸功能的GDNF-PI3K-AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究在針刺大腸俞募穴治療功能性便秘療效肯定的基礎(chǔ)上，探討俞募穴治療功能性便秘中EGC細(xì)胞及GDNF-PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用，旨在探索針刺大腸俞募穴治療該病的效應(yīng)機(jī)制，以期為針刺治療本病的臨床選穴及應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)一選昆明小鼠80只，隨機(jī)分為以下5組：空白對照組、模型組、針刺組、藥物組、空白針刺組，每組各16只。采用復(fù)方地芬諾酯灌胃法復(fù)制功能性便秘模型，選取雙側(cè)天樞、

2、大腸俞交替針刺，每次電針治療30min，1次/d，5次為一個療程，療程之間休息2d，共治療2個療程。分別于第1、2療程結(jié)束后取胃、小腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸，檢測胃排空率、小腸推進(jìn)率、結(jié)腸平滑肌張力變化幅度。
　　2、實(shí)驗(yàn)二、三選昆明小鼠80只，隨機(jī)分為以下5組：對照組、模型組、針刺組、EGC對照組、EGC針刺組，每組各16只。模型制作及電針操作同實(shí)驗(yàn)一。各組分別于第1、2療程結(jié)束后取遠(yuǎn)端結(jié)腸，運(yùn)用數(shù)字掃描顯微鏡、電鏡、細(xì)胞凋亡技術(shù)觀察結(jié)腸組

3、織形態(tài)、平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、平滑肌細(xì)胞凋亡情況；利用免疫組化、原位雜交、PCR及Western Blot法檢測GDNF-PI3K-Akt信號通路及其下游mTOR蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、胃腸傳輸功能檢測：
　　（1）胃排空率
　　模型組小鼠胃排空明顯延遲（P<0.01），針刺和藥物均可顯著加快便秘小鼠的胃排空速度（P<0.01，P<0.01）；空白對照組與空白針刺組比較，兩者胃排空率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

4、（P>0.05）。第1、2療程間進(jìn)行比較，各組胃排空率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　?。?）小腸推進(jìn)率
　　模型組小鼠小腸推進(jìn)率明顯減慢（P<0.01），針刺和藥物均可顯著加快便秘小鼠的小腸推進(jìn)速度（P<0.01，P<0.01）；空白對照組與空白針刺組比較，兩者小腸推進(jìn)率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。第1、2療程間進(jìn)行比較，各組小腸推進(jìn)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　?。?）結(jié)腸平滑肌平均張力變化

5、百分?jǐn)?shù)
　　模型組小鼠結(jié)腸平滑肌張力變化幅度呈降低趨勢，但與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與模型組比較，針刺可增強(qiáng)便秘小鼠的結(jié)腸平滑肌張力變化幅度（P<0.05）；空白對照組與空白針刺組比較，兩者結(jié)腸平滑肌張力變化幅度百分?jǐn)?shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。第1、2療程間比較，各組內(nèi)結(jié)腸平滑肌張力變化不明顯（P>0.05）。
　　2、結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察
　　對照組結(jié)腸神經(jīng)叢數(shù)量較多，內(nèi)可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排

6、列整齊均勻。模型組結(jié)腸神經(jīng)叢數(shù)量減少，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列紊亂，內(nèi)見空泡樣變，細(xì)胞數(shù)量減少。針刺組結(jié)腸形態(tài)學(xué)與空白對照組比較無顯著性改變。EGC對照組和EGC針刺組結(jié)腸組織形態(tài)改變與模型組相似，兩者形態(tài)改變差別不明顯。
　　3、平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察
　　對照組平滑肌細(xì)胞染色質(zhì)分布均勻，線粒體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，核糖體等結(jié)構(gòu)清晰。模型組平滑肌細(xì)胞細(xì)胞核染色質(zhì)聚集，線粒體明顯腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。針刺組平滑肌細(xì)胞染色質(zhì)分布均勻，胞漿中線粒

7、體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，核糖體等結(jié)構(gòu)清晰。EGC對照組和EGC針刺組比較，兩者平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化不明顯。
　　4、平滑肌細(xì)胞凋亡檢測
　　與對照組比較，模型組凋亡細(xì)胞陽性表達(dá)率增強(qiáng)（P<0.01）；與模型組比較，針刺組凋亡細(xì)胞陽性表達(dá)率下降（P<0.01）；抑制EGC細(xì)胞后，針刺對平滑肌細(xì)胞凋亡的改善作用不明顯（P>0.05）。第1、2療程組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，各組隨療程變化均不明顯（P>0.05）。
　　5、GDNF-PI3K

8、-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路檢測
　　（1）GDNF蛋白的表達(dá)
　　與對照組比較，模型組結(jié)腸內(nèi)GDNF蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，針刺組GDNF蛋白的含量升高（P<0.01）；抑制EGC后，針刺對GDNF蛋白表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用不明顯（P>0.05）。第1、2療程間進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，EGC針刺組2個療程時GDNF蛋白的表達(dá)水平與1個療程比較顯著升高（P<0.05），其余組變化均不明顯（P>0.05）。
　　

9、（2）Rai蛋白及其mRNA的表達(dá)
　　與對照組比較，模型組結(jié)腸內(nèi)Rai蛋白及其mRNA的表達(dá)水平降低（P<0.01，P<0.05）；與模型組比較，針刺組Rai蛋白及其mRNA的表達(dá)水平呈增強(qiáng)趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與EGC對照組比較，EGC針刺組結(jié)腸內(nèi)Rai蛋白及其mRNA的表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05，P<0.05）。第1、2療程組內(nèi)進(jìn)行比較，對照組2個療程時Rai蛋白的表達(dá)水平與1個療程比較顯著升高（P<0.01

10、），其余組兩者表達(dá)水平隨療程變化不明顯（P>0.05，P>0.05）。
　　（3）RET蛋白及其mRNA的表達(dá)
　　與對照組比較，模型組結(jié)腸內(nèi)RET蛋白及其mRNA的含量顯著降低（P<0.01，P<0.01）；與模型組比較，針刺組兩者的表達(dá)水平增強(qiáng)（P<0.01）；與EGC對照組比較，EGC針刺組結(jié)腸內(nèi)RET蛋白及其mRNA的表達(dá)水平變化不明顯（P>0.05，P>0.05）。第1、2療程組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，各組內(nèi)兩者的表達(dá)水平變化

11、均不明顯（P>0.05，P>0.05）。
　?。?）PI3K、Akt表達(dá)水平
　　與對照組比較，模型組結(jié)腸內(nèi)PI3K、Akt的含量升高（P<0.01）；與模型組比較，針刺組Akt的表達(dá)水平降低（P<0.05），PI3K的表達(dá)水平呈下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。EGC對照組與EGC針刺組比較，兩組PI3K、Akt的表達(dá)水平變化均不明顯（P>0.05，P>0.05）。第1、2療程組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，各組PI3K、Akt

12、的表達(dá)水平變化均不明顯（P>0.05，P>0.05）。
　?。?）mTOR蛋白的表達(dá)
　　與對照組比較，模型組結(jié)腸內(nèi)mTOR蛋白的含量升高（P<0.01）；針刺可抑制結(jié)腸內(nèi)mTOR的表達(dá)，但與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；EGC對照組與EGC針刺組比較，mTOR表達(dá)水平的變化不明顯（P>0.05）。第1、2療程組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，各組mTOR的表達(dá)水平變化均不明顯（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、在

13、健康狀態(tài)下，針刺大腸俞募穴對胃腸傳輸功能的改善作用不明顯。
　　2、在疾病狀態(tài)下，針刺大腸俞募穴可能通過促使EGC分泌產(chǎn)生GDNF，調(diào)控PI3K-Akt信號通路，下調(diào)mTOR的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善結(jié)腸組織形態(tài)及胃腸傳輸功能，治療功能性便秘。
　　3、抑制EGC后，針刺大腸俞募穴對結(jié)腸組織形態(tài)、GDNF-PI3K-Akt信號通路表達(dá)水平的調(diào)控作用不明顯。從反面證實(shí)了EGC細(xì)胞在針刺大腸俞募穴治療功能性便秘中的重要作用。