胞苷酸羥甲基化酶MilA的酶學(xué)特性研究及改造.pdf

1、米多霉素生物合成中的胞苷酸羥甲基化酶MilA，是迄今發(fā)現(xiàn)的首個(gè)高效利用核糖核苷酸底物（胞苷酸CMP）的羥甲基化酶。然而，其所在超家族中的胸苷酸合成酶（TS）和脫氧胞苷酸羥甲基化酶（CH），均高效利用脫氧核糖核苷酸底物（分別是脫氧尿苷酸dUMP和脫氧胞苷酸dCMP）。它們對(duì)于核糖/脫氧核糖底物選擇性的機(jī)理尚未闡明，而這正是核苷酸代謝研究中的重要問(wèn)題。
　　本研究通過(guò)表征MilA對(duì)于底物CMP和dCMP的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，證實(shí)了該酶對(duì)于C

2、MP的底物偏好性，其對(duì)CMP的催化效率（kcat/KM）約為dCMP的8.5倍。H218O喂養(yǎng)MilA的體外反應(yīng)結(jié)果表明，18O被引入到產(chǎn)物的羥甲基中，這證明MilA與CH具有相似的催化機(jī)制，為后續(xù)的MilA同源蛋白結(jié)構(gòu)比較提供了基礎(chǔ)。
　　MilA及其同源蛋白的氨基酸序列和預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果表明，它們之間的氨基酸序列一致性雖然不足30％，但是它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示出較高的一致性。預(yù)測(cè)出的MilA三維結(jié)構(gòu)也與CH晶體結(jié)構(gòu)相吻合。氨

3、基酸序列和活性位點(diǎn)比對(duì)結(jié)果顯示，MilA底物結(jié)合口袋中Lys133和Ala176可能因其較短的側(cè)鏈，使得該口袋較大，從而能夠高效率地催化CMP。
　　根據(jù)這一假說(shuō)設(shè)計(jì)、構(gòu)建并純化了3個(gè)MilA單氨基酸突變酶（MilA K133R、A176S、A176T）和2個(gè)雙氨基酸突變酶A176S/K133R、A176T/K133R，它們?cè)诎被嵛稽c(diǎn)133和176處具有不同程度較長(zhǎng)的氨基酸側(cè)鏈。這些突變酶的體外催化反應(yīng)表明，MilAA176T和