小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1表面CCL5表達調(diào)控的研究.pdf

1、目的:
　　乳腺癌作為威脅女性身心健康首位的惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。由于發(fā)病原因尚未完全闡明，因此預(yù)防、早期篩查和診斷便成為治愈的關(guān)鍵，這就使得分子生物技術(shù)倍受關(guān)注。CCL5趨化細(xì)胞因子是一種炎癥細(xì)胞因子，趨化T細(xì)胞和單核細(xì)胞，在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中具有多重效應(yīng)，包括抑制腫瘤細(xì)胞的免疫效應(yīng)、促進腫瘤的生長、新血管的生成和轉(zhuǎn)移等，也是乳腺腫瘤細(xì)胞表達的主要趨化因子，與乳腺癌的進展息息相關(guān)，p38是細(xì)胞內(nèi)重要的信號通路，可以調(diào)節(jié)很

2、多細(xì)胞因子的表達。本實驗擬對LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞系引起CCL5的表達升高的機制展開進一步研究。
　　方法:
　　1 用RT-PCR和Western Blot的方法檢測小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1表面TLR4的表達及誘導(dǎo)表達。
　　2 LPS誘導(dǎo)4T1細(xì)胞，提取總RNA，用RT-PCR檢測MCP-1、VEGF和CCL5在基因水平的表達情況。同時用實時定量PCR的方法進行檢測MCP-1、VEGF和CCL5在基因水平的表

3、達情況。
　　3 用Western Blot的方法檢測LPS誘導(dǎo)4T1細(xì)胞后MAPK中T-p38和P-p38、T-Erk和P-pErk、T-JNK和P-JNK及NF-κB中T-p65和P-p65的蛋白表達變化。
　　4 采用實時定量PCR的方法來檢測使用通路抑制劑后LPS誘導(dǎo)的4T1細(xì)胞的CCL5的表達。
　　5 構(gòu)建攜帶目的基因重組質(zhì)粒并在小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。在熒光素酶檢測儀上進行熒光素酶的數(shù)

4、據(jù)測定。
　　6 劃痕實驗和Transwell實驗檢測p38抑制劑對4T1細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。
　　7 用免疫印跡法來檢測使用p38抑制劑后的4T1細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的表達。
　　結(jié)果:
　　1 LPS誘導(dǎo)及未誘導(dǎo)的兩組4T1細(xì)胞在基因和蛋白水平均有TLR4的表達。
　　2 在基因水平上，LPS誘導(dǎo)4T1細(xì)胞組與未誘導(dǎo)4T1細(xì)胞組相比較，CCL5表達明顯升高，而MCP-1和VEGF的表達沒有明顯變化。

5、
　　3 LPS刺激4T1細(xì)胞后，可以導(dǎo)致p38、Erk、JNK和p65明顯磷酸化升高。
　　4 CCL5在使用p38和p65的阻斷劑后的表達有差異，且p38阻斷劑組與p65阻斷劑組相比而言差異更加顯著，阻斷Erk、JNK后CCL5的表達無明顯變化。
　　5 熒光素酶檢測的結(jié)果表明，LPS在4T1細(xì)胞上導(dǎo)致的CCL5表達的增高是通過導(dǎo)致啟動子表達增高實現(xiàn)的。
　　6 p38抑制劑可以抑制4T1細(xì)胞的遷移能力而對侵