EIAV誘導(dǎo)的特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答檢測(cè)方法的建立.pdf_第1頁
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1、馬傳染性貧血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)是一種雙鏈RNA病毒,屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)慢病毒亞科(Lentivirus),是嚴(yán)重危害養(yǎng)馬業(yè)的馬傳染性貧血(EIA)病原體。馬傳染性貧血病毒(EIAV)主要侵害宿主的免疫系統(tǒng)。馬傳貧病毒在急性發(fā)病期主要在組織中分化的巨噬細(xì)胞中復(fù)制,病毒可以進(jìn)入存在于外周血未分化的單核細(xì)胞,但不能在單核細(xì)胞內(nèi)復(fù)制形成成熟的病毒粒子。馬傳染性

2、貧血病毒進(jìn)入機(jī)體后,首先受到固有免疫系統(tǒng)的攻擊,包括生理屏障和非特異性免疫細(xì)胞及其分泌的各種免疫分子。然后是特異性免疫系統(tǒng)的攻擊,包括體液免疫和細(xì)胞免疫,由于其主要是通過細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸進(jìn)行擴(kuò)散,接觸不到體液,所以細(xì)胞免疫在抗馬傳染性貧血病毒中起主要作用。主要通過CD8+T細(xì)胞接受內(nèi)源性抗原刺激后分化增殖為細(xì)胞毒性T細(xì)胞發(fā)揮免疫作用。機(jī)體細(xì)胞免疫的檢測(cè)對(duì)于某些疾病的診斷和發(fā)病機(jī)理研究、免疫治療或預(yù)防接種的效果評(píng)估及環(huán)境因素對(duì)機(jī)體免疫功

3、能的影響,都具有重要的意義。我國(guó)自主研制的EIAV弱毒疫苗是目前世界上唯一能夠克服抗原變異而產(chǎn)生有效保護(hù)的慢病毒疫苗,也是迄今為止唯一廣泛應(yīng)用的慢病毒疫苗。通過對(duì)已成功的慢病毒疫苗免疫應(yīng)答本質(zhì)的探索,可以為HIV等其他慢病毒疫苗的研究提供借鑒。但由于相應(yīng)檢測(cè)方法的缺乏,限制了對(duì)于EIAV弱毒疫苗的免疫保護(hù)機(jī)制的全面認(rèn)知。特別是,在近幾年的研究中,本實(shí)驗(yàn)室利用建立的相關(guān)方法對(duì)弱毒疫苗和強(qiáng)度疫苗免疫誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的特點(diǎn)的對(duì)比性分析,顯示出細(xì)

4、胞免疫應(yīng)答對(duì)EIAV弱毒疫苗免疫保護(hù)中具有重要作用。因此,建立相關(guān)的免疫檢測(cè)方法具有重要意義。
   本項(xiàng)研究擬建立馬屬動(dòng)物ELISPOT的檢測(cè)方法,使之能夠用于EIAV感染后IFN-γ表達(dá)情況的研究。同時(shí),應(yīng)用建立的方法對(duì)EIAVp26蛋白的有效表位進(jìn)行初步探討,旨在找到能夠誘導(dǎo)免疫保護(hù)的保守性表位。為EIAV的免疫保護(hù)機(jī)制的研究以及新型疫苗的構(gòu)建提供重要的科學(xué)依據(jù)。
   首先,從14試驗(yàn)馬的外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC

5、(Peripheral blood mononuclear cells)提取總RNA,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后進(jìn)行T-A克隆。每匹馬隨機(jī)挑取約10~20個(gè)陽性克隆用于序列比對(duì)及等位基因多態(tài)性的量化分析。結(jié)果顯示,14匹試驗(yàn)馬各自具有2~4個(gè)等位基因,為正在開展的針對(duì)EIAV減毒疫苗核心蛋白(p26)的CTL表位的篩選提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。其次,建立了一種操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的細(xì)胞免疫ELISPOT檢測(cè)方法,可以對(duì)馬

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