Sirt1-Fox01在高糖誘導(dǎo)小鼠系膜細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的:
　　糖尿病腎病(diabetic nephropathy DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥。以糖尿病腎病為原發(fā)病的終末期腎衰發(fā)病率逐年上升。在我國，每年花費(fèi)大量的人力、物力、財(cái)力維持這些病人的治療。然而糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，臨床上治療糖尿病腎病有待于新的突破。目前，雖然對于DN的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，但是大量研究證實(shí)氧化應(yīng)激在DN的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了非常重要的作用。糖尿病的機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，促進(jìn)了臟器實(shí)質(zhì)細(xì)胞的損害

2、和凋亡的發(fā)生。ROS的產(chǎn)生與高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cel1，MC)凋亡密切相關(guān)。而FoxO1(Forkhead Box，F(xiàn)OX)是PI3K/AKT信號通路中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。在氧化應(yīng)激環(huán)境中，PI3K/AKT信號通路會促使FoxO1發(fā)生去磷酸化作用并增加其結(jié)合下游因子DNA的能力，從而定位于細(xì)胞核，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。FoxO1與氧化應(yīng)激及氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)。以前的研究已證實(shí)抑制FoxO1能夠保護(hù)脂肪酸

3、和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的胰腺β細(xì)胞的凋亡。同時(shí)也有實(shí)驗(yàn)表明，Sirt1對FoxO1具有明顯的調(diào)控作用。然而，到目前為止，有關(guān)FoxO1與系膜細(xì)胞凋亡的具體關(guān)系以及Sirt1對FoxO1的作用還未見報(bào)道。在本項(xiàng)目中我們擬通過體外培養(yǎng)細(xì)胞，采用Sirt1激活劑SRT1720和FoxO1小干擾RNA敲低FoxO1表達(dá)，觀察Sirt1/FoxO1與腎臟系膜細(xì)胞凋亡的關(guān)系。為了研究在慢性腎臟疾病中腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。我們進(jìn)一步檢測了凋亡相關(guān)蛋白

4、和部分凋亡相關(guān)信號通路。為慢性腎臟疾病的治療提供新思路。
　　方法:
　　采用FoxO1 shRNA干擾質(zhì)粒和Sirt1激活劑SRT1720進(jìn)行干預(yù)。使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將FoxO1 shRNA質(zhì)粒和對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染MMCs，G418篩選穩(wěn)定的MMCs細(xì)胞系。以正常糖濃度(NG)培養(yǎng)的MMCs為對照，以HG刺激MMCs。TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞數(shù)目，Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)Sirt1、F

5、oxO1、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、caspase-3、SOD1、SOD2、p47，NOX4、β-actin蛋白的表達(dá)。RT-PCR檢測細(xì)胞Bax和Bcl-2的mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、FoxO1和Sirt1在系膜細(xì)胞表達(dá)
　　Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與NG組相比，HG組FoxO1的表達(dá)明顯增加。FoxO1 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能明顯抑制高糖誘導(dǎo)的FoxO1過表達(dá)。

6、證實(shí)FoxO1 shRNA對MMC的FOXO1上調(diào)抑制效果明顯。與NG組相比，HG組Sirt1表達(dá)明顯減少。Sirt1激活劑SRT1720能夠明顯提高高糖條件下Sirt1的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)FoxO1的表達(dá)。FoxO1 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對Sirt1的表達(dá)無明顯影響。
　　2、敲低FoxO1表達(dá)和SRT1720明顯抑制高糖誘導(dǎo)的MMC凋亡
　　TUNEL結(jié)果顯示，與NG組相比，HG組MMC凋亡明顯增多，與HG組和載體對照組相比，

7、FoxO1 shRNA轉(zhuǎn)染或SRT1720能夠顯著抑制HG誘導(dǎo)的MMC凋亡。表明FoxO1表達(dá)與高糖誘導(dǎo)的MMC凋亡密切相關(guān)。
　　3、敲低FoxO1表達(dá)和SRT1720下調(diào)高糖誘導(dǎo)的Bax/Bcl-2比值。
　　Western blot及RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NG組相比，HG組Bax/Bcl-2mRNA水平和蛋白表達(dá)比率顯著增加。與HG組和載體對照組相比，F(xiàn)oxO1shRNA轉(zhuǎn)染和SRT1720分別能夠明顯降低Bax

8、/Bcl-2 mRNA和蛋白的比率。表明FoxO1與高糖誘導(dǎo)的MMC凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2表達(dá)情況密切相關(guān)。
　　4、敲低FoxO1表達(dá)和SRT1720抑制高糖誘導(dǎo)的cleaved Caspase-3表達(dá)
　　Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NG組相比，HG組活化的Cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)明顯提高。FoxO1 shRNA轉(zhuǎn)染或SRT1720干預(yù)后，高糖誘導(dǎo)的Cleaved caspase-3的

9、高表達(dá)明顯被抑制。證實(shí)，F(xiàn)oxO1的活化與高糖誘導(dǎo)的MMC凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3表達(dá)情況密切相關(guān)。
　　5、敲低FoxO1表達(dá)和SRT1720對高糖誘導(dǎo)的SOD1、SOD2、p47及NOX4表達(dá)的影響
　　Western blot結(jié)果顯示，與NG組相比，HG組過氧化物酶SOD1，SOD2蛋白表達(dá)水平明顯降低;p47及NOX4蛋白表達(dá)則明顯增多。與HG組和載體對照組相比，轉(zhuǎn)染FoxO1 shRNA質(zhì)粒或

10、SRT1720干預(yù)能夠明顯上調(diào)高糖抑制的SOD1和SOD2表達(dá)，同時(shí)抑制p47及NOX4蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1、高糖能夠上調(diào)系膜細(xì)胞FoxO1蛋白的表達(dá);敲低FoxO1或Sirt1的激活劑SRT1720能夠減少HG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及Bax/Bcl-2、Cleaved caspase-3的表達(dá)。
　　2、高糖能夠下調(diào)sirt1的表達(dá);Sirt1的激活劑SRT1720能夠抑制高糖誘導(dǎo)的FoxO1的表達(dá)。