豬4個(gè)候選印記基因的分離、定位、印記狀況和組織表達(dá)分析.pdf

1、基因組印記是指子代中來自父母雙方的等位基因的差異表達(dá)，即有些基因只有父源的等位基因有表達(dá)活性，而母源等位基因則處于沉默狀態(tài)；反之，有的基因只表達(dá)母源等位基因，而父源等位基因保持沉默，具有這種現(xiàn)象的基因稱為印記基因。研究表明，印記基因常成簇分布在染色體上并構(gòu)成印記域；大多數(shù)印記基因是調(diào)控家畜生長(zhǎng)發(fā)育的主基因，這些基因?qū)倚笈咛ピ缙诎l(fā)育與出生后的生長(zhǎng)速度、產(chǎn)肉量、瘦肉率、飼料效率等數(shù)量性狀有著極大影響。此外，印記基因還與某些疾病的易感性和免

2、疫性等有著密切的關(guān)系。因此，在豬中鑒定更多的印記基因并分析它們?cè)诓溉閯?dòng)物之間的保守性，對(duì)尋找新的家畜改良和育種工具有著重要意義并為豬分子遺傳育種提供基礎(chǔ)分子生物學(xué)信息。
　　 大量研究表明，人的7q32和11p15.5及鼠的同線性染色體區(qū)域分別存在MEST/PEG1和CDKN1C/KCNQ1OT1印記域，這2個(gè)印記域內(nèi)分布著具有重要的生物學(xué)功能并與SRS、BWS等疾病形成相關(guān)的基因。為了證實(shí)豬中該2個(gè)印記域的存在，本研究選取CO

3、PG2、MEST、CDKN1C和NAP1L4作為候選基因，以長(zhǎng)白豬、榮昌豬及其F1代個(gè)體為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，利用比較生物學(xué)與分子生物學(xué)方法，克隆COPG2、MEST、CDKN1C和NAP1L4基因，并分析其基因序列特點(diǎn)；然后利用IMpRH(法國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院的輻射雜種克隆板)分析上述4個(gè)基因在豬染色體上定位信息；通過RT-PCR產(chǎn)物直接測(cè)序方法分析了這些基因在F1代個(gè)體組織的印記狀況；并進(jìn)一步利用Real-time PCR方法，分析其在初生或一月齡

4、F1代個(gè)體不同組織的表達(dá)情況，取得了如下結(jié)果：
　　 1，利用PCR和RACE技術(shù)獲得了4個(gè)候選基因的完整cDNA序列：(1)獲得了豬COPG2全長(zhǎng)2817 bp cDNA序列，該序列包含35 bp的5'UTR、166 bp的3’UTR和2616 bp的ORF，序列已提交至GenBank中，登錄號(hào)為GU372414；COPG2核苷酸序列與人、鼠的COPG2核苷酸序列同源性分別為93％和89％，豬的COPG2編碼的氨基酸序列與人、

5、鼠的COPG2編碼的氨基酸序列同源性為96％和95.5％；(2)獲得了豬MEST基因2167 bp核苷酸序列，該序列包含16 bp的5’UTR、1222 bp的3’UTR和981 bp的ORF，序列已提交至GenBank中，登錄號(hào)為HM126537；豬的MEST核苷酸序列與人、鼠的MEST核苷酸序列同源性分別為84％和88％；(3)獲得了豬CDKN1C基因1171 bp核苷酸序列，該序列包含786 bp的ORF，序列已提交至GenBan

6、k，登錄號(hào)為HQ679903；(4)獲得了豬NAP1L4基因全長(zhǎng)2655 bp cDNA序列，該序列包含470 bp的5’UTR、1024 bp的3’UTR和1161 bp的ORF，序列已提交至GenBank，登錄號(hào)為HQ679902；豬的NAP1L4氨基酸序列和核苷酸序列與人的NAP1L4氨基酸序列和核苷酸序列同源性分別為94％和86％。
　　 2，利用長(zhǎng)白豬×榮昌豬或榮昌豬×長(zhǎng)白豬模型，通過PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法，鑒定了4個(gè)候

7、選印記基因的印記狀況。(1)豬COPG2基因在一月齡豬心臟、胃、肌肉、腎、肺、膀胱、舌頭、脂肪、肝臟、小腸和脾臟中均呈雙等位表達(dá)；(2)豬MEST基因在一月齡豬心臟、胃、肌肉、腎、肺、膀胱、舌頭和脂肪中表達(dá)父源等位基因，為母源印記基因，但在肝臟、小腸和脾臟中呈雙等位表達(dá)；(3)豬CDKN1C基因在初生豬心臟、舌頭、膀胱、卵巢、脾臟、肝臟、肌肉、胃、小腸和胎盤中表達(dá)母源等位基因，為父源印記基因，但在肺和腎臟中呈雙等位表達(dá)。(4)豬NAP1

8、L4基因在初生豬心臟、舌頭、膀胱、卵巢、脾臟、肝臟、肌肉、胃、小腸、胎盤、肺和腎臟中均呈雙等位表達(dá)。
　　 3，利用豬RPL32基因?yàn)閮?nèi)參，通過Real-time PCR方法，采用2-ΔΔCt方法分析熒光定量結(jié)果，并進(jìn)行單因素方差分析，以探明其組織表達(dá)譜。(1)初生豬COPG2基因在胎盤中的表達(dá)量最高，其次是脾臟、卵巢、心、肌肉、舌頭和腎臟，在肝臟、小腸、胃、肺和膀胱中的表達(dá)量相對(duì)最低；一月齡豬COPG2基因在腎臟中表達(dá)量最高，

9、其次是肺，在胃、肌肉、肝、小腸、舌頭和脾中相對(duì)表達(dá)量較低。(2)MEST基因在初生豬胎盤組織中表達(dá)量顯著高于其它組織(P<0.01)；在一月齡豬腎臟中表達(dá)量高于同時(shí)期其他組織(P<0.01)，此外豬MEST基因的表達(dá)量隨著出生發(fā)育后逐漸降低。(3)CDKN1C基因在初生豬胎盤組織中表達(dá)量顯著高于其它組織(P<0.01)；在一月齡豬肺和腎臟中表達(dá)量最高(P<0.01)，肌肉和心中表達(dá)量次之(P<0.01)，在脾臟、舌頭、膀胱、胃、肝臟、脂

10、肪和小腸中的表達(dá)量最低(P<0.01)，CDKN1C在懷孕30天梅山豬胎盤組織中的表達(dá)量顯著高于懷孕60天、90天和105天梅山豬胎盤的組織表達(dá)量，并且隨著胎盤發(fā)育其表達(dá)量逐漸降低。(4)NAP1L4基因在初生豬胎盤組織中表達(dá)量顯著高于其它組織(P<0.01)，在肝臟和胃中的表達(dá)量最低(P<0.01)；在一月齡豬肺、心和腎臟中的表達(dá)量最高(P<0.01)，在脾臟和舌頭中的表達(dá)量最低(P<0.01)；NAP1L4在懷孕30天梅山豬胎盤組織

11、中的表達(dá)量顯著高于懷孕60天、90天和105天梅山豬胎盤的組織表達(dá)量，并且隨著胎盤發(fā)育其表達(dá)量逐漸降低。
　　 4，用IMpRH克隆板，對(duì)豬COPG2、MEST、CDKN1C和NAP1L4進(jìn)行了定位，結(jié)果表明COPG2和MEST被定位在SSC18q1.2-q2.2，與CL365941緊密連鎖，LOD值分別為14.32和8.5；CDKN1C和NAP1L4被定位在SSC2，與IMpRH06175緊密連鎖，LOD值分別為15.78和1