普羅布考在動脈粥樣硬化模型中改善高密度脂蛋白功能的研究.pdf

1、一研究背景：
　　 動脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病的共同發(fā)病基礎(chǔ)。低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平升高是造成AS病理改變最重要的危險(xiǎn)因素之一,LDL-C通過多種機(jī)制誘發(fā) AS。近20年的大型的臨床隨機(jī)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明,降低 LDL-C能讓病人在臨床治療中獲益,因此,國內(nèi)外指南均把降低 LDL-C水平作為預(yù)防和治療AS的一個(gè)重要手段。但是,臨床上LDL-C水平達(dá)到指南要求的標(biāo)準(zhǔn)后,僅能降低患者30％的心血管事件,依然殘留60-

2、70％心血管事件發(fā)生率。因此,我們認(rèn)為除了降低 LDL-C的治療手段外,尋找新的治療靶點(diǎn)預(yù)防和治療AS志在必行,而干預(yù)高密度脂蛋白(HDL)是預(yù)防和控制AS的一個(gè)很重要治療靶點(diǎn)。
　　 流行病學(xué)資料表明,血清 HDL-C濃度與冠心病(CAD)發(fā)病率呈負(fù)相關(guān),HDL顆粒是AS的保護(hù)因素之一,升高HDL—C水平是抗 AS的靶點(diǎn)之一。NCEPATPⅢ把HDL-C<40mg/dL當(dāng)作冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,血清HDL-C水平每升高1mg/

3、dl,男性患者CAD的危險(xiǎn)性降低2％,女性降低3％。然而,HDL顆粒與AS的關(guān)系比我想像中更加復(fù)雜,在載脂蛋白AI(apoA-I)轉(zhuǎn)變?yōu)閍poA-IMilano人群中,HDL-C的水平降低,但其CAD的發(fā)生率也低；膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)抑制劑torcetrapib雖然能升高HDL-C水平,但結(jié)果卻增加了患者心臟事件發(fā)生率和全因死亡率。以上的資料顯示,血清HDL-C水平并不能反映HDL的整體功能,正常功能的 HDL具有抗AS的一系列

4、作用,而功能受損的HDL(既失功能HDL)不僅缺乏正常HDL的功能,并且表現(xiàn)出了促AS進(jìn)展的作用。
　　 HDL的心血管保護(hù)作用主要體現(xiàn)在逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)(Reverse CholesterolTransport,RCT)及抗炎抗氧化功能。RCT是指 HDL將外周細(xì)胞內(nèi)多余的膽固醇轉(zhuǎn)移到肝臟,肝臟將膽固醇以膽汁形式分泌進(jìn)消化道,最后通過糞便排出體外。由于過多的膽固醇可使巨噬細(xì)胞等變成泡沫細(xì)胞而促進(jìn) AS發(fā)生,因此逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)對人體來

5、說尤為重要。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體 A1(ABCA1)和清道夫受體-BI(SR-BI)是RCT過程中兩個(gè)最重要受體,在血清脂蛋白的生成和代謝以及維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇平衡中起著重要的作用。
　　 HDL的抗炎抗氧化作用同樣在防止 AS進(jìn)展方面起到重要作用。血清對氧磷酶1(PON1)是由肝臟合成的糖蛋白,主要存在與 HDL上,與HDL結(jié)合后防止 HDL被氧化,增加HDL的抗氧化功能,發(fā)揮血管保護(hù)作用。髓過氧化物酶(MPO)是一種在中性粒

6、細(xì)胞和單核細(xì)胞中含量豐富的血色素酶,MPO參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展,可以氧化修飾HDL上的 apoA-I,從而降低HDL抗炎抗氧化功能,同時(shí)還可以氧化LDL形成具有強(qiáng)致AS作用的Ox-LDL,降低MPO活性可以提高 HDL的抗炎抗氧化能力,發(fā)揮抗AS作用。
　　 普羅布考(probucol)又名丙丁酚,化學(xué)名為4,4’-[(1-甲基亞乙基)雙(硫基)]雙[2,6-雙(1,1-二甲基乙基苯酚],是一種獨(dú)特的調(diào)脂藥,臨床上用于治療高

7、血脂癥尤其是雜合子家族性高膽固醇血癥。普羅布考具有高脂溶性,隨脂蛋白顆粒進(jìn)入機(jī)體組織中,普羅布考可以使患者皮膚黃色瘤消退,AS斑塊縮小。但降低膽固醇的同時(shí),普羅布考也降低了血清HDL-C水平,為什么普羅布考降低了HDL-C后仍能發(fā)揮強(qiáng)大的抗動脈硬化效果,其中機(jī)制尚未完全清楚。我們課題組成員去年對普羅布考改善 HDL的RCT功能的機(jī)制做了相關(guān)研究,但是關(guān)于普羅布考是否促進(jìn)主動脈斑塊內(nèi)細(xì)胞及肝細(xì)胞.ABCA1、SR-B1表達(dá),通過何種機(jī)制改

8、善 HDL抗炎抗氧化功能尚未進(jìn)行深入探討。
　　 二研究目的：
　　 本研究通過建立AS模型,觀察經(jīng)普羅布考處理后的AS兔主動脈斑塊內(nèi)細(xì)胞及肝細(xì)胞.ABCAl、SR-BI的表達(dá)情況,以反映HDI的RCI能力；檢測血清PON1和MPO活性探討普羅布考改善HDL抗炎抗氧化作用的機(jī)制；檢測血脂、主動脈內(nèi)中膜厚度(IMT)和動脈斑塊/血管面積比的變化情況,以確定其抗AS的效果。通過分析普羅布考對上述指標(biāo)的改變情況,從而探討其通過

9、何種機(jī)制改善HDL功能并發(fā)揮抗AS作用。
　　 三實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)分組
　　 18只新西蘭健康雄性大白兔(體重2.0±0.11Kg,合格證號:scxk粵2006-0015)隨機(jī)分為:(1)正常對照組(n=6):給予普通飼料喂養(yǎng)；(2)AS組(n=6):給予高脂飼料喂養(yǎng)；(3)普羅布考組(n=6):在飼以高脂飲食基礎(chǔ)上給予普羅布考400 mg/(kg·d)。
　　 2、血脂檢測
　　 分別

10、于實(shí)驗(yàn)第0周和第12周取靜脈血,酶法測定甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平
　　 3、HDL抗炎抗氧化功能的檢測
　　 采用分光光度計(jì)法測定血清PON1活性及血清MPO活性。
　　 4、ABCA1及 SR-B1受體 mRNA及蛋白表達(dá)水平檢測
　　 (1)肝組織總RNA的提取用 Trizol提取法,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)進(jìn)

11、行相對定量檢測肝組織ABCA1及 SR-BI的 mRNA的表達(dá)量。
　　 (2)免疫組化法標(biāo)記主動脈 ABCA1及 SR-BI受體表達(dá)情況,使用 Image proplus6.0圖片分析軟件分析主動脈壁上ABCA1或SR-B1表達(dá)情況:ABCA1和SR-BI表達(dá)面積百分比(％),ABCA1和 SR-BI表達(dá)平均光密度值。
　　 5、病理組織學(xué)觀察主動脈斑塊形成情況
　　 實(shí)驗(yàn)第12周收集主動脈標(biāo)本,甲醛固定液固定

12、,常規(guī)制組織石蠟切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,顯微鏡下觀察其組織病理改變,并測量其內(nèi)中膜厚度(IMT)及動脈斑塊/血管面積比。
　　 四結(jié)果：
　　 1、實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(0周),取兔靜脈血查血脂四項(xiàng)示:各組動物間TC(F=0.921,P=0.420),TG(F=0.453,P=0.644),LDL-C(F=0.003,P=0.997)和HDL-C(F=0.338,P=0.718)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,入選實(shí)驗(yàn)動物基線統(tǒng)一。實(shí)

13、驗(yàn)12周以后,在消除實(shí)驗(yàn)開始時(shí)血脂四項(xiàng)指標(biāo)的影響后,各組進(jìn)行組間比較:與對照組相比,AS組血清 TC(23.26±3.30 vsl.79±0.21,P=0.000)、TG(1.58±0.25 vs1.02±0.15,P=0.000)、LDL—C(18.09±4.04 vs1.09±0.23,P=0.000)、HDL-C(1.11±0.09 vs0.45±0.12,P=0.000)水平顯著升高。與AS相比,普羅布考組TC(16.70±0.

14、70 vs23.25±3.30,P=0.000)、LDL-C(13.79±2.01 vs18.09±4.04,P=0.015)和HDL-C(0.51±0.06 vs1.11±0.09,P=0.000)水平顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但兩組間血清 TG(1.60±0.17 vs1.58±0.25,P=0.826)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3組進(jìn)行0周與12周組內(nèi)比較:正常對照組干預(yù)前后TC(1.85±0.12 vs1.79±0.21,t=0.5

15、38,P=0.614)、TG(1.04±0.19 vs1.02±0.15,t=0.162,P=0.878)、LDL-C(1.00±0.20 vs1.09±0.23,t=0.566,P=0.0.596)、HDL—C(0.47±0.12 vs0.45±0.12,t=0.369,P=0.0.727)無顯著改變,普通飼料喂養(yǎng)前后血脂無顯著變化。AS組干預(yù)前后:TC(1.77±0.15 vs23.26±3.30,t=16.603,P=0.000)

16、,TG(1.10±0.14vs1.58±0.25,t=4.498,P=0.006),LDL—C(1.00±0.20 vs18.09±4.04,t=10.251,P=0.000),HDL-C(0.48±0.12 vs1.11±0.09,t=14.615,P=0.000)顯著改變,高脂飼料對血脂影響顯著,AS模型成功建立。普羅布考組干預(yù)前后:TC(1.76±0.11 vs16.70±0.70,t=48.680,P=0.000),TG(1.0

17、2±0.15 vs1.60±0.17,t=6.956,P=0.001),LDL-C(1.00±0.15 vs13.79±2.01,t=16.244,P=0.000)顯著改變,但是HDL-C(0.43±0.10 vs0.51±0.06,t=1.612,P=0.168)無顯著影響。
　　 2、實(shí)驗(yàn)12周,三組兔PON1活性變化(F=29.24,P=0.000):與正常對照組(96.77±5.58 U/ml)比較,AS組(72.26±

18、12.03 U/ml)血清PON1活性顯著降低(P=0.001),而普羅布考組(118.20±12.21 U/ml)較AS組顯著升高(P=0.000),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三組兔MPO活性變化(F=46.994,P=0.000):與正常對照組(14.94±6.36 U/L)比較,AS組(85.67±17.92 U/L)血清MPO活性顯著升高(P=0.001),而普羅布考組(44.11±10.65 U/L)較AS組顯著降低(P=0.000

19、),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3、實(shí)驗(yàn)12周,肝細(xì)胞ABCA1(F=32.904,P=0.000)及SR-B1(F=48.993,P=0.000)mRNA表達(dá)情況:與正常組ABCA1(1.00±0.03)mRNA和SR-BI(1.00±0.02)mRNA相比,AS組ABCA1 mRNA(0.61±0.12,P=0.000)和SR-BImRNA(0.63±0.11,P=0.000)表達(dá)量顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)意義；與AS組相比,普

20、羅布考組ABCA1 mRNA(0.87±0.08,P=0.000)和SR-BI mRNA(1.34±0.13,P=0.000)表達(dá)量顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)意義。
　　 4、實(shí)驗(yàn)12周,免疫組化染色觀察主動脈ABCA1及SR-B1表達(dá)情況:與AS組比較,普羅布考組的主動脈斑塊內(nèi)ABCA1表達(dá)面積百分比(％)(45.25±11.22％vs24.13±9.85％,t=3.464,P=0.006)和SR-BI表達(dá)面積百分比(％)(46.2

21、2±11.56％ vs18.81±7.58％,t=4.858,P=0.001)增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與AS組比較,普羅布考組主動脈斑塊內(nèi)SR-BI表達(dá)平均光密度值升高(0.25±0.04 vs0.18±0.03,t=3.286,P=0.001),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；雖然 ABCA1表達(dá)平均光密度值增高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.19±0.03 vs0.17±0.03,t=1.405,P=0.190)。
　　 5、實(shí)驗(yàn)12周,H

22、E染色觀察主動脈內(nèi)中膜厚度及斑塊面積的組織病理學(xué)特點(diǎn):三組主動脈內(nèi)中膜厚度(IMT)顯著改變(F=52.83,P=0.000),與正常對照組(203.20±30.61 um)比較,AS組(527.41±85.16 um)IMT(P=0.000),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與AS組比較,普羅布考組(239.83±50.51 um)IMT(P=0.000),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常對照組主動脈壁未發(fā)現(xiàn)粥樣硬化斑塊,故只測量AS組和普羅布考組斑塊/血

23、管內(nèi)膜表面積百分比,與AS組(27.77±12.01％)相比,普羅布考組斑塊/血管內(nèi)膜表面積百分比(5.92±3.38％)顯著減小,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.289,P=0.002)。
　　 五結(jié)論：
　　 1.普羅布考降低AS兔血清 TC、LDL-C、HDL-C水平。
　　 2.普羅布考通過上調(diào)AS兔主動脈斑塊內(nèi)細(xì)胞及肝細(xì)胞 SR-BI、ABCA1的表達(dá),增強(qiáng)逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)作用。
　　 3.普

24、羅布考通過增加血清PON1活性,降低血清MPO活性從而增強(qiáng)HDL抗氧化、抗炎功能。
　　 4.普羅布考明顯減輕 AS狀態(tài)下的主動脈內(nèi)中膜厚度(IMT)及斑塊/血管內(nèi)膜表面積百分比,具有抗AS作用。
　　 5.血清HDL-C水平并不能準(zhǔn)確代表HDL功能,雖然普羅布考降低 HDL-C,但增強(qiáng)了 HDL功能:通過增強(qiáng)主動脈斑塊細(xì)胞及肝細(xì)胞SR-BI、ABCA1的表達(dá)及提高血清PON1、降低MPO活性提高HDL功能,減輕動脈粥樣