向日葵花盤(pán)抗腫瘤有效組分篩選及其活性機(jī)制研究.pdf

1、向日葵在我國(guó)種植廣泛，向日葵花盤(pán)、葉、莖稈等副產(chǎn)品資源來(lái)源豐富，但一般都作為飼料、燃料或廢棄物處理，不但污染環(huán)境，而且嚴(yán)重浪費(fèi)資源，工業(yè)附加值極低。在傳統(tǒng)中醫(yī)藥領(lǐng)域中向日葵具有極高的藥用價(jià)值，全株均可入藥，具有防治癌癥、降血壓、提高免疫力等多種療效，目前對(duì)其藥用組分及相關(guān)功能活性的確證研究稀少。因此，研究和開(kāi)發(fā)向日葵資源藥用組分，對(duì)于深入探索向日葵藥用組分的活性功能，促進(jìn)向日葵資源中藥現(xiàn)代化利用具有重要意義。
　　本文研究了向日葵

2、（除籽之外）資源藥用組分分布和積累規(guī)律，針對(duì)向日葵抗腫瘤活性組分進(jìn)行了篩選，并對(duì)其抗腫瘤活性作用機(jī)制進(jìn)行了研究，以期對(duì)向日葵藥用資源和抗腫瘤活性組分的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)，主要研究結(jié)果如下：
　　(1)以總多酚、總黃酮、總多糖和綠原酸為研究目標(biāo)，對(duì)向日葵各個(gè)生長(zhǎng)階段的藥用組分在植株內(nèi)的分布和積累規(guī)律進(jìn)行研究，結(jié)果表明，以多糖為采收目的物質(zhì)應(yīng)選擇成熟期花盤(pán)，除此之外，向日葵藥用資源的采集應(yīng)首選花期的向日葵花盤(pán)和現(xiàn)蕾期的葉。
　　(

3、2)采用勻漿萃取法分別制備了報(bào)道或驗(yàn)方中提及的具有抗腫瘤活性的向日葵植株部位——根、莖髓和花盤(pán)總提取物，其中花盤(pán)總提取物得率最高，為13.33％。對(duì)向日葵花盤(pán)提取物按照極性大小進(jìn)行分級(jí)處理，獲得了二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物4個(gè)極性段萃取物，其中水萃取物得率最高，其次為二氯甲烷萃取物。
　　(3)通過(guò)MTT法和S180荷瘤鼠模型考察了向日葵根、莖髓和花盤(pán)總提取物，以及向日葵花盤(pán)二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取

4、物、正丁醇萃取物和水萃取物4個(gè)極性段萃取物的體外和體內(nèi)抗腫瘤活性，結(jié)果表明，花盤(pán)總提取物的體外和體內(nèi)抗腫瘤活性是各部位提取物中最好的，而二氯甲烷萃取物的體外和體內(nèi)抗腫瘤活性均優(yōu)于向日葵花盤(pán)提取物，因此判斷二氯甲烷萃取物是向日葵花盤(pán)提取物中抗腫瘤活性最好的藥用組分。
　　(4)通過(guò)人類(lèi)胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、熒光顯微鏡觀察、流式細(xì)胞術(shù)法以及Western-blot法研究了向日葵花盤(pán)二氯甲烷萃取物(HHDE)的抗腫瘤作用

5、機(jī)制，結(jié)果表明，HHDE具有顯著的抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性，且其抗腫瘤活性的劑量相關(guān)性顯著大于時(shí)間相關(guān)性，作用濃度≥0.25mg/mL時(shí)24h即可顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制率≥58％。伴隨著HHDE濃度的增加，倒置顯微鏡和熒光顯微鏡均可以觀察到劑量相關(guān)的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，Annexin-Ⅴ-FITC/PI法和細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果均顯示腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)了顯著的凋亡，同時(shí)線粒體膜電位下降，ROS、Ca2+水平顯著升高。Western-blot結(jié)果顯示

6、線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C表達(dá)下降，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞色素C表達(dá)增加，表明細(xì)胞色素C由線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，同時(shí)Caspase-3、Caspase-9前體蛋白表達(dá)下降，證明Caspase-3、Caspase-9已經(jīng)被激活。另外，Bcl-2蛋白表達(dá)下降，Bax蛋白表達(dá)上升，Bax/Bcl-2比例上升。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，HHDE抗腫瘤作用機(jī)制主要是通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的。
　　(5)通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)法對(duì)HH

7、DE的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，結(jié)果表明HHDE中可能含有包括8個(gè)倍半萜類(lèi)化合物，6個(gè)二萜類(lèi)化合物的14種化合物成分，其中文獻(xiàn)報(bào)道grandifloric acid具有顯著抗腫瘤活性，其余化合物未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。
　　(6)通過(guò)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法從HHDE中鑒定出35種化合物，占HHDE總揮發(fā)性物質(zhì)的93.26％。含量最高的8種化合物占HHDE總揮發(fā)性物質(zhì)的63.26％。綜合文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果，并通過(guò)MTT法驗(yàn)證茴芹內(nèi)酯、海松酸和β