上海地區(qū)和其他來源沙門氏菌的多樣性及其分子基礎(chǔ).pdf

1、沙門氏菌是一種非常重要的食源性致病菌，在世界范圍導(dǎo)致了非常嚴(yán)重的食品安全問題，同時(shí)也造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和健康負(fù)擔(dān)。沙門氏菌分布廣泛，但禽類及其制品為其最主要寄主。因此，分析禽類特別是健康禽類中沙門氏菌的分布對(duì)于預(yù)防和控制沙門氏菌感染導(dǎo)致的食源性疾病具有重要的意義。自上世紀(jì)四十年代以來，由于抗生素的長時(shí)間大量使用以及很多情況下的濫用，導(dǎo)致沙門氏菌等致病菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，同時(shí)由于耐藥基因的廣泛傳播從而使得新的耐藥菌株甚至超級(jí)耐藥菌株不斷

2、出現(xiàn)，因此，有必要對(duì)來自飼料、禽類以及食品等各種來源的致病菌進(jìn)行耐藥性評(píng)估以及相關(guān)耐藥基因進(jìn)行分析。由于進(jìn)出口食品，飼料等產(chǎn)品具有廣泛流通性特征，通過分子分型等手段分析其中沙門氏菌的多樣性及相關(guān)性，有利于了解沙門氏菌的流行、傳播規(guī)律并能為沙門氏菌的監(jiān)測和控制提供指導(dǎo)。鑒于以上這些原因，本論文的主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 1.對(duì)上海市的大型養(yǎng)殖場取樣550份進(jìn)行沙門氏菌分離鑒定和多樣性分析，確定25株為沙門氏菌，其中包含7種不

3、同的血清型。對(duì)這些分離株使用MLST方法進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)它們分屬于6個(gè)不同的序列型(分別為ST-11，ST-19，ST-92，ST-96，ST-290和ST-367)。使用14種常用抗生素對(duì)分離到的沙門氏菌分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，對(duì)四環(huán)素和強(qiáng)力霉素耐藥性最普遍，共有13株顯示耐藥或中介耐藥水平，有兩株分離株表現(xiàn)對(duì)第一代頭孢菌素耐藥。
　　 2.根據(jù)上海市禽類養(yǎng)殖場沙門氏菌分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果選取6種抗生素對(duì)來自不同國家和

4、地區(qū)的飼料、食品以及禽肉產(chǎn)品中的沙門氏菌進(jìn)行耐藥性評(píng)估，同時(shí)使用VITEK全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)對(duì)這些分離株進(jìn)行臨床藥物的敏感性測定，并與來自上海市禽類養(yǎng)殖場的分離株進(jìn)行聯(lián)合分析。結(jié)果顯示，這些不同來源的沙門氏菌分離株對(duì)呋喃妥因、四環(huán)素以及鏈霉素具有較強(qiáng)的耐藥性，耐藥率分別為19.8％、15.7％和11.6％，而所有菌株對(duì)第三代頭孢菌素都敏感。從樣品來源看，出現(xiàn)耐藥菌株最多的是禽類樣品，一共17株(44.7％)，其中多重耐藥的為10株(2

5、6.3％)；其次是食品樣品，一共13株(40.6％)，其中多重耐藥的為3株(9.4％)；來自飼料樣品的耐藥菌株比較少，一共9株(17.6％)，其中多重耐藥的為1株(2.0％)。
　　 3.對(duì)121株沙門氏菌分離株進(jìn)行整合子分析發(fā)現(xiàn)，SJTUF12201，SJTUF12208以及SJTUF12237菌株含有第一類整合子，對(duì)其所含耐藥基因盒的分析發(fā)現(xiàn)，在SJTUF12201和SJTUF12208所含的整合子中都發(fā)現(xiàn)了大小為789bp

6、的aadA5和大小為474bp的dfr17兩種基因盒，而在SJTUF12237中則是大小為792bp的aadA2和大小為498bp的dfr12兩種基因盒?；蚝衋adA5和aadA2的相似性為65％，但是都能編碼對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥的修飾酶；而dfr17和dfr12的相似性為51.6％，但都能編碼對(duì)甲氧芐啶類抗生素耐藥的二氫葉酸還原酶。
　　 據(jù)報(bào)道，四環(huán)素類抗生素的耐藥基因多達(dá)29個(gè)，針對(duì)腸道菌中比較常見的四環(huán)素耐藥基因te

7、t(A-E)，通過PCR分析顯示，本研究中所有四環(huán)素耐藥菌株都含有tet(A)基因，而且部分菌株還同時(shí)具有tet(B)基因。未發(fā)現(xiàn)有tet(C-E)的耐藥基因，而且在四環(huán)素耐藥性為中介的菌株中均未發(fā)現(xiàn)這5種四環(huán)素耐藥基因。
　　 4.為了分析來自飼料，禽類及食物中的121株沙門氏菌的相關(guān)性，使用MLST對(duì)這些來自13個(gè)國家和地區(qū)的沙門氏菌分離株進(jìn)行分析，同時(shí)與傳統(tǒng)的血清學(xué)分型進(jìn)行對(duì)照。通過血清分型，這些菌株被分為36個(gè)不同的血清

8、型，其中，三種血清型(S.Babelsberg，S.Fresno和S.Ⅱ)在中國大陸未見報(bào)道。本研究的MLST分型結(jié)果顯示，ST-92是最多的一個(gè)序列型，同屬于這一個(gè)型的有16株菌；接下來是ST-367，同屬于這一型的有14株菌。本研究中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)新的沙門氏菌等位基因型，這7個(gè)新的等位基因型與其他的等位基因型一起組成了9個(gè)新的序列型，已被沙門氏菌MLSI國際數(shù)據(jù)庫接受。本研究的結(jié)果顯示，MLST分型結(jié)果與基于表型的血清分型結(jié)果能較好的吻

9、合，與樣品的地理分布及樣品種類有一定的相關(guān)性，但與分離株的耐藥譜沒有明顯的相關(guān)性。
　　 5.從121株分離株中隨機(jī)選擇61株沙門氏菌進(jìn)行核糖體分型分析，并將其與MLST及血清分型結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，核糖體分型結(jié)果與多位點(diǎn)序列分型及血清分型結(jié)果基本一致。使用辛普森指數(shù)比較三種基于不同原理的分型方法的分辨能力，結(jié)果顯示，核糖體分型得到48個(gè)核糖體型，其辛普森指數(shù)為D=0.9896；多位點(diǎn)序列分型得到36個(gè)序列型，其辛普森指數(shù)為

10、D=0.9678；血清分型得到29個(gè)血清型，其辛普森指數(shù)為D=0.9596。從辛普森指數(shù)可以看出核糖體分型的分型能力最強(qiáng)。但是從核糖體分型的結(jié)果可以看出，其分型過于靈敏，將MLST和血清分型一致的菌株也分成了不同的型，因此不利于流行病學(xué)分析。與以血清分型為代表的表型分型方法以及與核糖體分型相似的電泳圖譜方法相比，MLST方法在分型以及數(shù)據(jù)處理時(shí)人為參與程度最小，分析方法比較客觀，而且結(jié)果為全數(shù)字化，有利于不同國家不同研究單位之間交流、共