DON誘導PC12細胞凋亡線粒體信號轉(zhuǎn)導機制的研究.pdf

1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）是世界范圍內(nèi)常見的一種真菌毒素，廣泛存在于農(nóng)作物及飼料產(chǎn)品中。研究發(fā)現(xiàn)，DON對人和畜禽具有神經(jīng)毒性、免疫毒性、生殖和發(fā)育毒性以及―三致毒性等。由于神經(jīng)系統(tǒng)的復雜性，人們對DON神經(jīng)毒性的認識還不全面，目前仍處于探索階段。關(guān)于DON對神經(jīng)細胞毒性的體外研究鮮有報道，尤其在線粒體途徑引起的凋亡信號傳導機制方面。PC12細胞是一種優(yōu)越的神經(jīng)細胞模型，被普遍用在神經(jīng)機理方面的研究。因此

2、，本試驗選擇PC12細胞作為研究對象，從線粒體途徑研究DON致使PC12細胞凋亡的具體機理。本試驗首先以不同濃度DON（0、125、250、500、1000、2000 ng·mL-1）處理對數(shù)生長期的PC12細胞24 h后，采用倒置顯微鏡及透射電鏡觀察PC12細胞形態(tài)學變化，hoechst33258探查核酸的邊集情況，annexin V-FITC/PI染色測定凋亡率，流式細胞儀檢測線粒體膜電位，熒光定量PCR檢測凋亡相關(guān)基因的表達，we

3、stern-blot分析凋亡相關(guān)蛋白的表達，免疫熒光檢測Caspase3激活以及EMSA法檢測P53、AIF的轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)果顯示：
　　1.不同濃度DON處理PC12細胞24 h后，對照組細胞多為長梭形，細胞間鏈接緊密；處理組細胞（圖2-1 B-F）稀疏，且DON濃度越大，細胞數(shù)量越少，細胞凸起消失，失去本來的伸展狀態(tài)。電鏡下可見對照組細胞核正常、核仁清晰，染色質(zhì)分布均勻，線粒體結(jié)構(gòu)正常以及豐富的脊；而處理組細胞均出現(xiàn)

4、了核膜皺縮、染色質(zhì)聚集、線粒體腫脹、脊消失，部分線粒體空泡變性等明顯的細胞凋亡特征。Hoechst33258染色發(fā)現(xiàn)，對照組細胞核呈現(xiàn)均勻的藍光；而DON處理組呈現(xiàn)明亮的藍色，且隨著DON濃度的升高，出現(xiàn)的明亮藍色比例以及亮度均不同程度增加。
　　2.與對照組相比，處理組PC12細胞活性隨著DON濃度的升高而極顯著降低（P<0.01）；乳酸脫氫酶（LDH）的釋放量在DON濃度125~1000 ng·mL-1時略微增加，呈現(xiàn)出微弱的

5、量效關(guān)系；DON濃度達到2000 ng·mL-1時，LDH的釋放量極顯著增加（P<0.01）。
　　3.DON能誘導PC12細胞產(chǎn)生凋亡，各處理組凋亡率均極顯著升高（P<0.01），DON濃度在125~1000 ng·mL-1時，凋亡率呈濃度依賴性升高，而DON濃度為2000 ng·mL-1時，細胞凋亡率反而較1000 ng·mL-1有所降低。因此，本試驗選擇1000 ng·mL-1DON濃度處理組，作為后續(xù)試驗添加caspase

6、8抑制劑（FMK）的最佳濃度。
　　4.與對照組相比，處理組PC12細胞線粒體膜電位（MMP）隨著DON濃度的升高呈極顯著降低（P<0.01）。而與1000 ng·mL-1DON處理組相比，1000ng·mL-1 DON+caspase8抑制劑處理組MMP呈極顯著升高（P<0.01）。
　　5.與對照組相比，處理組PC12細胞Bax mRNA表達水平和Bax/Bcl-2比值均極顯著增加（P<0.01），且隨著DON濃度的增加

7、而升高，在1000 ng·mL-1時達到峰值；而Bcl-2 mRNA表達水平隨著DON濃度的增加而降低，在濃度超過500 ng·mL-1時極顯著下降（P<0.01），在濃度為1000 ng·mL-1時達到最小值。Bid mRNA表達水平在DON濃度超過250 ng·mL-1時極顯著升高（P<0.01），并隨著DON濃度的增加而升高，在濃度為1000 ng·mL-1時達到峰值。與1000 ng·mL-1 DON處理組相比，1000 ng·

8、mL-1 DON+FMK處理組Bax和Bid mRNA表達水平以及Bax/Bcl-2比值均極顯著降低（P<0.01），而Bcl-2 mRNA表達水平極顯著升高（P<0.01）。
　　6.與對照組相比，處理組PC12細胞cleaved-Caspase9蛋白表達量極顯著升高（P<0.01），并隨著DON濃度的增加而升高，在1000 ng·mL-1時達到最大值；cleaved-Caspase3蛋白表達量在濃度超過500 ng·mL-1時

9、極顯著增加（P<0.01），同樣也在DON濃度為1000 ng·mL-1時達到峰值；線粒體中AIF、Cyt C蛋白表達量隨著DON濃度的增加極顯著降低（P<0.01），在1000 ng·mL-1時達到最低。與1000 ng·mL-1DON處理組相比，1000 ng·mL-1 DON+FMK處理組cleaved-Caspase9和cleaved-Caspase3均極顯著降低（P<0.01），AIF蛋白表達量極顯著增加（P<0.01），而C

10、ytC蛋白表達量也有所增加，但差異不顯著。
　　7.采用激光共聚焦顯微鏡觀察Caspase3的激活情況，可見對照組細胞基本上無紅色熒光，而處理組細胞均出現(xiàn)不同程度的紅色熒光，且隨著DON濃度的升高而增強，在1000 ng·mL-1達到最高。另外，與1000 ng·mL-1DON處理組相比，1000 ng·mL-1 DON+FMK處理組紅色熒光明顯減弱。
　　8.與對照組相比，處理組PC12細胞轉(zhuǎn)錄因子AIF、P53的轉(zhuǎn)錄活性

11、均明顯增加，并隨著DON濃度的增加而升高。與1000 ng·mL-1DON處理組相比，1000 ng·mL-1 DON+FMK處理組細胞轉(zhuǎn)錄因子AIF、P53的轉(zhuǎn)錄活性明顯降低。
　　綜上所述，DON由于改變了細胞形態(tài)，損害了細胞膜和細胞核，從而引發(fā)PC12細胞凋亡。同時，DON降低了線粒體膜電位，導致Bax、Bid的上調(diào)及Bcl-2的下調(diào)。另外，DON促進了Cyt C、AIF從線粒體釋放以及cleaved-Caspase3和cl