精液氧化應激檢測及其在輔助生殖技術中的應用.pdf

1、第一部分、精液氧化應激水平與男性不育的相關性研究
　　 目的：通過化學發(fā)光法檢測不育男性及志愿者原始精液中活性氧(ROS)水平，以探討精液氧化應激水平與精液質(zhì)量的相關性。
　　 方法：不育對象來自2005.1—2007.12在上海市計劃生育科學研究所附屬生殖醫(yī)院不孕不育門診進行精液檢查的男性，共451例不育男性和50名志愿者納入本研究；
　　 使用計算機輔助精子分析系統(tǒng)檢測精子密度，動力學參數(shù)等指標；
　　

2、 使用Diff-Quik染色法評價精子形態(tài)學指標；
　　 使用化學發(fā)光法檢測所有研究對象原始精液中活性氧水平，使用白細胞特異探針FMLP檢測白細胞；
　　 采用匹配的方法選擇30份精液，按照活性氧水平分為低、中、高三組，離心分離精漿后，進行人類精子活力試驗(HSMA)以評價三組精漿對精子運動的毒性作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.志愿者和不育男性原始精液中ROS水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3、>　　 2.451份不育患者精液ROS水平呈偏鋒分布，中位數(shù)為9.68 RLU/s每20×106精子。
　　 3.以50名志愿者精液ROS水平的95百分位數(shù)作為閾值，將不育患者精液分為氧化應激陰性組和陽性組，陽性率為46.6％。
　　 4.相關性分析提示：精子主要的動力學參數(shù)和部分形態(tài)學指標與ROS水平存在相關。
　　 5.根據(jù)FMLP激惹試驗結(jié)果，將氧化應激陽性的精液標本分為白細胞主導的和非白細胞主導的氧化應

4、激陽性。其中，白細胞因素約為24.3％。
　　 6.HSMA的結(jié)果表明氧化應激水平對精子的毒性有劑量-效應關系。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究檢測了451份不育男性患者精液的ROS水平，氧化應激陽性率為46.6％，其中精漿白細胞因素約占24.3％。
　　 2.原始精液ROS水平與精子的活率和形態(tài)學參數(shù)顯著相關3.體外精子活力試驗表明氧化應激對精子有毒性作用。
　　 第二部分、一種檢測精子質(zhì)膜損傷

5、的新技術
　　 目的：建立一種適宜臨床用于檢測人類精子質(zhì)膜完整性并評價氧化應激對精子質(zhì)膜損傷程度的新技術。
　　 方法：
　　 1.篩選出新的熒光染料Transgreen，配合PI，代替市售昂貴的LIVE/DEADSperm Viability Kit試劑盒檢測精子質(zhì)膜完整性。熒光染料使質(zhì)膜完整的精子發(fā)綠色熒光，質(zhì)膜不完整的精子發(fā)紅色熒光。在熒光顯微鏡下計數(shù)綠色精子的百分比，即存活率(viability)。

6、>　　 2.用Transgreen/PI復染法與LIVE/DEAD Sperm Viability Kit檢測同一批精子標本，分析檢測結(jié)果的相關性。
　　 3.以不同的順序和間隔時間加入Transgreen和PI檢測同一批精子標本，以比較Transgreen和PI與精子核的親和力大小。
　　 4.采用體外培養(yǎng)法觀察各種染料對精子運動的毒性作用。
　　 5.用Transgreen/PI熒光復染法檢測451份不育男

7、性精子的存活率；分析精液中氧化應激水平和精子質(zhì)膜完整性的關系。
　　 6.用熒光酶標儀檢測Transgreen與LIVE/DEAD Sperm Viability Kit中的SYBR-14染料與精子共孵育時的熒光強度隨時間的變化曲線。
　　 7.通過熒光酶標儀檢測綠色熒光的強度，加入Transgreen或SYBR-14后所有精子激發(fā)綠色熒光，強度測得A；再加入PI，PI將死精子中與染色體結(jié)合的綠色染料取代，此時再測綠色熒

8、光強度B，定義一個新的指標--精子存活系數(shù)=B/A，即代表活精子(質(zhì)膜完整的精子)發(fā)光強度與所有精子發(fā)光強度的比值。
　　 8.用熒光酶標儀間隔5 min檢測同一批精液標本兩次，分析時間(觀察者內(nèi))的可靠性(精確性)；用熒光顯微鏡下計數(shù)法做同樣的檢測。比較兩種方法的可靠性(精確性)。
　　 9.將同一份精液洗滌濃縮，再稀釋為不同的密度組，用熒光酶標儀檢測其存活系數(shù)。
　　 10.用熒光酶標儀和熒光顯微鏡下計數(shù)法檢

9、測同一批精液標本，分析檢測結(jié)果的相關性，探討存活系數(shù)是否能夠替代傳統(tǒng)指標存活率。
　　 結(jié)果：
　　 1.Transgreen/PI與LIVE/DEAD Sperm Viability Kit復染法檢測同一批精子存活率，相關系數(shù)R=0.927，P<0.001。
　　 2.精液中Transgreen和PI染料加入順序?qū)哟婊盥实臋z測結(jié)果沒有影響(P>0.05)。
　　 3.Transgreen/PI與LI

10、VE/DEAD Sperm Viability Kit一樣，在加入后2h內(nèi)，不影響精子的正常運動功能(P>0.05)。
　　 4.用Transgreen/PI熒光顯微鏡下計數(shù)檢測不育男性精子存活率，氧化應激陰性和陽性組精子存活率差異有統(tǒng)計學意義。
　　 5.Transgreen穿膜進入精子并與染色體結(jié)合即可用熒光酶標儀檢測到綠色熒光，熒光強度上升較平緩，約40～50min到達平衡。SYBR-14上升較快，約20min到達

11、平衡。
　　 6.同種方法不同時刻兩次測量精子質(zhì)膜完整性，使用熒光酶標儀時，R=0.971，P<0.001；使用熒光顯微鏡下計數(shù)法時，R=0.869，P<0.01。
　　 7.同一份精液稀釋為不同密度組，用熒光酶標儀檢測存活系數(shù)，組間差異無統(tǒng)計學意義。
　　 8.存活系數(shù)和存活率的相關系數(shù)R=0.897，P<0.001。
　　 結(jié)論：
　　 1.Transgreen/PI與LIVE/DEAD Sp

12、erm Viability Kit檢測結(jié)果有非常好的一致性。因此Transgreen/PI可以作為精子存活率檢測的方法使用。
　　 2.PI與細胞核的親和力大于Transgreen，使用者不用考慮先加哪個試劑，甚至可以同時加入Transgreen和PI，即可在熒光顯微鏡或流式細胞儀中檢測精子的存活率。
　　 3.Transgreen/PI處理2h后對精子運動無毒性作用，因此不影響染色后在熒光顯微鏡下同時檢測存活率和活力，

13、而且熒光染料只對細胞染色的特征可以排除非細胞成分的干擾，因此精子計數(shù)將更準確。
　　 4.Transgreen與SYBR-14同DNA完全結(jié)合所用時間不同。因此應根據(jù)不同的核染料選擇恰當?shù)臅r間測量存活系數(shù)。
　　 5.氧化應激陰性組精子存活率高于陽性組，這與理論相符，也從側(cè)面反映了新型染料在臨床應用的價值，可成為今后評價精子抗氧化治療效果的良好指標。
　　 6.用新指標存活系數(shù)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的存活率來評價精子質(zhì)膜完整性

14、，該指標適合描述用熒光酶標儀間接檢測出的質(zhì)膜完整精子百分比。用熒光酶標儀測量精子存活系數(shù)的可靠性很高。而常用的熒光顯微鏡下計數(shù)法主觀因素強，樣品在載玻片上分布不均勻，測量的精子數(shù)量十分有限，因此誤差較大。而熒光酶標儀以樣品所有精子DNA的熒光強度為基礎進行測量，測量的精子數(shù)量巨大，對樣品信息的利用更多，很好地避免了隨機誤差。且基本上克服了研究者主觀因素的影響，提高了檢測效率。
　　 7.存活系數(shù)是一個比值，沒有單位，不受絕對熒光

15、強度的影響。不論精子數(shù)量多少，熒光強度多高，只要質(zhì)膜完整的精子比例恒定，存活系數(shù)也是一個定值。因此，使用熒光酶標儀無需事先處理精子，無需調(diào)整密度，可以直接加樣測量，十分方便。
　　 8.經(jīng)過相關性分析，熒光酶標儀和熒光顯微鏡下計數(shù)法的結(jié)果相關性較高，說明新指標存活系數(shù)能夠很好地反映存活率，用存活系數(shù)可以有效地評價精子質(zhì)膜的完整性。
　　 第三部分、中藥補腎生精湯抗氧化治療男性嚴重少、弱精子癥的研究
　　 目的：觀

16、察中藥補腎生精湯抗氧化治療男性嚴重少、弱精子癥患者的臨床效果。
　　 方法：將100例嚴重男性少、弱精子癥患者隨機分為中藥組(50例)和對照組(50例)，中藥組應用補腎生精湯治療并指導同房3個月，對照組僅指導同房。治療后仍然未育患者中有83例(中藥組38例，對照組45例)接受了卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)助孕；觀察用藥前、后常規(guī)精液指標(密度、活力等)和活性氧水平的變化及臨床妊娠情況；比較兩組繼續(xù)接受ICSI治療的患者MⅡ卵子

17、數(shù)、受精率、卵裂率、可用胚胎率、平均移植胚胎數(shù)、臨床妊娠率。
　　 結(jié)果：
　　 1.中藥組用藥前后患者精子的密度、活率、A+B級精子比例差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；精液ROS水平明顯下降(P<0.05)。
　　 2.有4例患者在服用中藥后自然受孕，均已分娩健康新生兒。其中2例在本研究前已接受過ICSI治療，受精率低，卵裂率低，胚胎質(zhì)量差未孕，經(jīng)過本次中藥治療后自然懷孕。對照組無自然受孕者。