豬流感病毒感染A549細胞的亞細胞蛋白組分析.pdf

1、豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)隸屬于分節(jié)段的單股負鏈RNA病毒正黏病毒科，除能感染豬體外，還具有感染人類的跨種間傳播能力。病毒基因組為分節(jié)段的8條單股負鏈RNA，編碼PB1、PB2、PA、NP、HA、NA、M1、M2、NS1及NEP(NS2)等10種以上蛋白。目前關于流感病毒跨種間感染的機制研究較少。本研究以SIV感染人肺上皮細胞A549為模型，應用亞細胞蛋白組學方法對SIV感染細胞的蛋白表達變化進行了

2、探索。
　　 4、SIV編碼蛋白的亞細胞定位
　　 采用純化病毒、Ni2+親和純化的原核表達蛋白NP、NS1、M1為免疫原，免疫BALB/c小鼠、新西蘭大白兔，分別獲得了NP蛋白單克隆抗體分泌細胞3株、M1蛋白單克隆抗體分泌細胞6株、NS1蛋白單克隆抗體分泌細胞6株及兔抗NP、NS1、M1蛋白多克隆抗體。采用熒光雙標法，以制備的抗體為工具，分析了H3N2、H1N1 SIV及A/PR8/34/H1N1(PR8)感染A549

3、細胞24小時后的病毒蛋白NP、NS1和M1的亞細胞定位及病毒蛋白之間的定位關系。結果顯示，H3N2、H1N1 SIV和PR8的NP蛋白主要集中分布于感染細胞的核內(nèi)，但胞質中也有分布。SIV的M1蛋白在感染細胞的胞核、胞質均有表達，但PR8的M1蛋白僅呈點狀分布于細胞核內(nèi)。SIV的NS1蛋白主要集中分布于感染細胞的核內(nèi)，PR8的NS1蛋白呈點狀分布于細胞核和細胞質。共定位分析顯示，僅在H3N2、H1N1 SIV感染細胞的核內(nèi)發(fā)現(xiàn)NS1與N

4、P的共定位關系。這些數(shù)據(jù)說明，兩個不同亞型SIV的NP蛋白與PR8的NP蛋白亞細胞分布相同，但M1和NS1蛋白的亞細胞分布存在差異。
　　 2、SIV感染細胞的胞質/胞核亞細胞蛋白質組分析
　　 以人肺上皮細胞A549感染豬流感病毒H3N2為感染模型，采用2-DE結合MS研究方法分析細胞感染后24小時的細胞質、細胞核亞細胞蛋白質組表達變化動態(tài)。MALDI-TOF/TOF質譜分析結果表明，胞質、胞核組分共有56個差異蛋白點

5、（對應43種蛋白）被鑒定成功（蛋白分數(shù)大于67，p≤0.05）。其中細胞質組分中對應19個上調蛋白點和15個下調蛋白點，細胞核組分中包含14個上調點和8個下調點。差異蛋白的生物功能學分析表明，SIV感染主要涉及到細胞死亡、壓力應答、脂類代謝、信號轉導及RAN轉錄和修飾方面。蛋白相互作用網(wǎng)絡(IPA)分析表明，H3N2 SIV感染主要激活NF-κB-IFN通路。同時通過對比H1N1 SIV感染，利用免疫印跡(WB)和免疫熒光(IFA)驗證

6、了差異蛋白的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)細胞蛋白WARS、IFI35、HSPB1、NMI、GNB1、GNB2等在病毒感染后有表達上調及入核的表現(xiàn)。免疫共沉淀分析顯示NS1與hnRNP C2存在相互作用關系。siRNA干擾和瞬時過表達分析顯示，與SIV H1N1感染細胞相比，WARS蛋白對SIV H3N2的M1、NP蛋白的合成量及病毒載量有明顯影響。
　　 3、SIV感染細胞的線粒體蛋白組學分析
　　 線粒體作為真核生物細胞內(nèi)最重要的一

7、種亞細胞器，參與了細胞凋亡、能量代謝、應激反應及免疫應答等許多方面。為了分析H3N2亞型豬流感病毒感染A549細胞后線粒體的應答反應，本研究采用2-DE結合MS鑒定方法，分析了SIV H3N2感染A549細胞后24小時的線粒體蛋白組變化。2-DE凝膠的比較分析表明，感染前后線粒體蛋白共有29個蛋白點發(fā)生了差異表達，包括上調蛋白點16個，下調蛋白點13個。MALDI-TOF/TOF質譜成功鑒定26個差異蛋白點（蛋白分數(shù)大于67，p≤0.0

8、5），對應12種上調蛋白，11種下調蛋白。差異蛋白的生物學功能分析表明，H3N2病毒感染涉及細胞形態(tài)、免疫應答及信號轉導蛋白的表達變化。差異表達蛋白的network網(wǎng)絡和pathway通路分析結果表明，氧化磷酸化通路(Oxidative phosphorylation)、整聯(lián)蛋白信號通路(Integrin signaling)是線粒體應答細胞感染的主要通路。實時熒光定量RT-PCR對SIV H3N2感染后24 h的16個細胞差異表達蛋白

9、的轉錄本分析表明，RNA加工及蛋白表達類基因、細胞死亡相關基因均是上調表現(xiàn);細胞間信號轉導類基因以上調為主;細胞蛋白組裝類基因以下調為主;能量合成類基因的變化不大。
　　 綜合以上信息，發(fā)現(xiàn)干擾素誘導表達蛋白Mx1，熱休克蛋白等在三組分中均有明顯上調，WARS在胞質、胞核組分中上調，hnRNPH家族蛋白在細胞核中上調，而在線粒體中下調。因此，本研究揭示的病毒感染后亞細胞蛋白質組信息為進一步開展SIV跨種間感染的分子致病機制奠定了