苯噻菌酯競爭和非競爭噬菌體酶聯(lián)免疫分析方法的研究.pdf

1、免疫分析具有簡單、快速、靈敏、低成本、高通量的特點，已在農藥殘留檢測中廣泛研究，異源競爭和非競爭模式是農藥殘留免疫分析的研究熱點之一。噬菌體展示技術為快速建立異源競爭和非競爭免疫檢測技術提供了途徑。本文通過制備苯噻菌酯模擬表位噬菌體展示多肽和抗苯噻菌酯免疫復合體噬菌體展示多肽，建立了靈敏度更高、特異性更強的苯噻菌酯免疫分析方法。
　　建立了苯噻菌酯高效液相色譜(HPLC)分析方法，采用C18反相色譜柱，檢測波長為230 nm，以乙

2、腈∶水(65∶35，v/v)為流動相，峰形對稱、響應值高。在0.05-10.0mg/L濃度范圍內，苯噻菌酯標準溶液的峰面積與質量濃度呈良好的線性關系。在番茄和大米基質中的平均添加回收率為80.83％-100.46％，相對標準偏差為0.25％-5.54％，滿足農藥殘留檢測的要求。
　　利用抗苯噻菌酯單克隆抗體，從環(huán)形八肽隨機噬菌體展示文庫(Ph.D.-C8Clibrary)中淘選出20種不同氨基酸序列的苯噻菌酯模擬表位噬菌體展示多肽

3、和3種抗苯噻菌酯免疫復合體噬菌體展示多肽。模擬表位多肽具有三種特征序列，分別為TPXGSL、GLAXFM和PXGAXH(X代表不同的氨基酸);抗免疫復合體多肽含有一種特征序列為PXIWPXXW為建立檢測苯噻菌酯的競爭和非競爭噬菌體酶聯(lián)免疫分析方法提供了必要的核心試劑。
　　利用淘選獲得的苯噻菌酯模擬表位噬菌體展示多肽，建立了苯噻菌酯競爭噬菌體ELISA方法。選擇了最優(yōu)的噬菌體C3-3，并對包被抗體濃度、噬菌體投入量以及緩沖液等條件

4、進行了優(yōu)化。在最優(yōu)條件下，競爭噬菌體ELISA的抑制中濃度(IC50)為0.94μg/L，最低檢測限(LOD，IC10)為0.22μg/L，線性范圍為(IC10-IC90)為0.22-3.94μg/L，靈敏度比傳統(tǒng)ic-ELISA方法提高了8倍。方法除與吡唑醚菌酯的交叉反應率為0.34％外，與其他結構類似物均無交叉反應。在番茄、梨、黃瓜和大米四種基質中的平均添加回收率為67.6％-119.6％，相對標準偏差為2.2％-12.8％，符合農

5、藥殘留檢測的要求。競爭噬菌體ELISA對真實樣品的檢測結果與HPLC的檢測結果接近，兩種方法對大米樣品中苯噻菌酯殘留量的檢測結果的相關性方程為y=0.948x+0.437，相關系數(shù)為R2=0.981;番茄樣品中的相關性方程為y=1.109x+11.88，相關系數(shù)為R2=0.981。研究結果表明，基于噬菌體展示多肽模擬表位可建立高靈敏的異源競爭免疫分析方法，檢測結果準確、可靠，可用于農產品中苯噻菌酯的檢測。
　　基于淘選獲得的抗苯噻

6、菌酯免疫復合體噬菌體展示多肽，建立了苯噻菌酯非競爭噬菌體ELISA方法.。選擇最優(yōu)的噬菌體N6-18，并對包被抗體濃度、噬菌體投入量以及緩沖液等條件進行了優(yōu)化。在最優(yōu)的工作濃度條件下，苯噻菌酯的飽和中濃度(SC50)為2.27μg/L，最低檢測限(LOD，SC10)為1.11μg/L，線性范圍為(SC10-SC90)1.11-4.62μg/L，靈敏度比傳統(tǒng)ic-ELISA方法提高了3倍，與其他結構類似化合物的交叉反應率均小于0.03％。

7、在番茄、梨、黃瓜和大米四種基質中的平均添加回收率為70.43％-128.57％，相對標準偏差為1.79％-11.53％，符合農藥殘留檢測的要求。非競爭噬菌體ELISA的檢測結果與HPLC的檢測結果相吻合，對大米樣品檢測結果的相關性方程為y=1.073x-9.558，相關系數(shù)為R2=0.996;對番茄樣品檢測結果的相關性方程為y=0.962x-7.429，相關系數(shù)為R2=0.997。研究結果表明，利用抗免疫復合體可建立苯噻菌酯非競爭免疫分