雞新城疫病毒地方流行株的分離鑒定及免疫程序的試驗(yàn)研究.pdf

1、新城疫(Newcastledisease，ND)是由新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)引起的接觸性、高度致死性的傳染病。自1926年確認(rèn)以來，曾經(jīng)是威脅世界養(yǎng)禽業(yè)的重大疾病，隨著疫苗的廣泛應(yīng)用，近年來鮮見大規(guī)模暴發(fā)新城疫的報(bào)道，但出現(xiàn)了多次免疫或者高抗體水平下仍然雞發(fā)病的情況。因此，對(duì)當(dāng)前的現(xiàn)場流行株進(jìn)行分離鑒定、強(qiáng)弱毒鑒別、序列分析及基因型分類等的研究，將有助于持續(xù)跟蹤毒株的變異規(guī)律。另外，根據(jù)毒株的變異

2、情況合理選用疫苗及修訂免疫程序，對(duì)完善ND的防控方案具有價(jià)值的參考。
　　 首先，本課題無菌采集廣西各地疑似NDV感染雞群病死雞的病料并接種于10d齡的SPF雞胚尿囊腔，觀察雞胚病變情況。尿囊液無菌檢驗(yàn)后進(jìn)行血凝試驗(yàn)(HA)，然后使用NDV陽性血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)(HI)，并采用RT-PCR進(jìn)行NDV的快速鑒定。結(jié)果表明，有11份病料接種的雞胚尿液均有血凝價(jià)，且能被NDV的陽性血清所抑制，不能被禽流感的陽性血清抑制；RT-PCR

3、的結(jié)果均能擴(kuò)增出一條約362bp的NDV特異性目的條帶，由此可判定成功地分離到11株NDV。用經(jīng)典的毒力判斷方法即雞胚平均致死時(shí)間(MDT)及1日齡腦內(nèi)接種致病指數(shù)(ICPI)對(duì)分離到的11株NDV分離株分別進(jìn)行毒力測定。結(jié)果表明GXY0803、GXY0903和GXY0904三個(gè)分離株為弱毒株，GXN0709、GXN0710、GXN0711、GXN0712、GXN0713、GXG1003、GXG1004、GXY1011八個(gè)分離株為強(qiáng)毒株

4、，結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室建立的應(yīng)用PT-PCR鑒定NDV強(qiáng)弱毒方法的結(jié)果相一致。然后，對(duì)11個(gè)NDV分離株F基因分別進(jìn)行克隆及測序。結(jié)果表明，強(qiáng)毒株GXN0710、GXN0711、GXN0712、GXN0713、GXN0709、GXG1003、GXG1004和GXY1011在F蛋白裂解位點(diǎn)的序列均為112R/K-R-Q-K/R-R-F117，符合強(qiáng)毒株的特征，毒株間的核苷酸同源性為95.5-99.9％，與GenBank上發(fā)表的NDV基因Ⅶ型的參

5、考株DQ485260和GXC1的同源性為94.1％-96.9％，而與弱毒疫苗株LaSota的同源性僅為83.4-84.9％，在系譜進(jìn)行化樹上同屬基因Ⅶd亞型；而弱毒株GXY0803、GXY0903和GXY0904在F蛋白裂解位點(diǎn)的序列均為112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117，符合弱毒株的特征，3個(gè)毒株間核苷酸同源性為99.7-99.9％，與弱毒疫苗株Clone30和LaSota的同源性為99.7-99.9％，而與基因Ⅶ型強(qiáng)毒株

6、DQ485260和GXC1的同源性僅為84.6-84.9％，在系譜進(jìn)行化樹上屬于基因Ⅱ型。
　　 最后，根據(jù)本地具體情況本課題分別設(shè)計(jì)了兩組免疫程序，其中試驗(yàn)一：A1組為臨床上大公司常用的免疫程序即5d齡使用ND+IB活苗1羽份進(jìn)行滴眼，10d齡用ND+IB活苗1羽份進(jìn)行滴眼，同時(shí)ND油苗0.4羽份頸部皮下注射，20d齡用NDI系2羽份肌肉注射及ND油苗0.4羽份頸部皮下注射，A2組對(duì)比A1組5d齡使用ND+IB活苗2羽份分別進(jìn)

7、行滴眼滴鼻，A3組與A4組在5d齡加上梅里亞的ND油苗(高力優(yōu))0.66羽份，觀察早期的保護(hù)率差異，A4組在20d齡取消NDI系的注射，A12組為對(duì)照組，不免疫任何ND疫苗；試驗(yàn)二：B1組為臨床上大公司常用的免疫程序，與試驗(yàn)一的A1組一樣，B3組比較B1組在5d齡使用ND+IB活苗2羽份分別進(jìn)行滴眼滴鼻同時(shí)取消20d齡NDI系的注射，B5組與B7組在5d齡加上自家ND油苗1羽份，觀察早期的保護(hù)率差異，B7組在20d齡取消NDI系的注射，

8、B9組為對(duì)照組，不免疫任何ND疫苗。所有試驗(yàn)雞分別在5d齡、14d齡、21d齡、28d齡、35d齡、42d齡、49d齡、56d齡、63d齡、70d齡(試驗(yàn)二為66d齡)采取雞的血清并測定其HI抗體和ELISA抗體，并在14d齡、28d齡、42d齡、56d齡(試驗(yàn)二為14d齡、28d齡、35d齡、66d齡)分別用參考強(qiáng)毒株F48E9和地方分離強(qiáng)毒株GXC1進(jìn)行攻毒。試驗(yàn)結(jié)果表明，未免疫ND疫苗的對(duì)照組抗體水平從14d齡開始逐漸下降，至35

9、d齡后趨勢(shì)于0，各攻毒天齡段的攻毒保護(hù)率均為0，而免疫組經(jīng)過弱毒疫苗(2次)結(jié)合滅活疫苗(2次)的免疫程序無論5d齡免疫1羽份或2羽分ND+IB活苗，5d齡是否免疫油苗，20d齡是否免疫NDI系，抗體水平變化規(guī)律相似，攻毒保護(hù)率相似，14d齡時(shí)的攻毒保護(hù)率絕大部分在80％以上，28d齡之后的攻毒保護(hù)率均為100％。
　　 本課題研究的結(jié)果表明，近年本地流行的NDV強(qiáng)毒株均屬于F基因的Ⅶ型d亞型，實(shí)驗(yàn)室建立針對(duì)病毒核酸的PT-PC