芹菜苷、3-甲氧基芹菜苷對AngⅡ誘導(dǎo)的HUVECs氧化損傷模型作用機制.pdf

1、本文首先利用血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)建立氧化損傷模型模擬體外高血壓細(xì)胞損傷模型，其次通過考察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活性、微觀結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡以及檢測細(xì)胞功能中氧化損傷標(biāo)志物丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(NOS)和超氧化物歧化酶(SOD)的活力來評價芹菜苷與3-甲氧基芹菜苷的修復(fù)效果，進(jìn)而選取功能活性較強的芹菜苷，再通過實時熒光定量PCR(real-time PCR)、蛋白質(zhì)印跡法(Wes

2、tern Blot)等技術(shù)來研明芹菜苷對血壓調(diào)節(jié)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)信號通路的影響，從而闡明芹菜苷在血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮修復(fù)作用的途徑，為芹菜黃酮調(diào)節(jié)血壓研究提供理論基礎(chǔ)，同時為高血壓病患者日常膳食提供有效的建議。主要的實驗結(jié)果及結(jié)論如下:
　　(1)以HUVECs為模型細(xì)胞，AngⅡ為誘導(dǎo)劑，篩選誘導(dǎo)劑的濃度和誘導(dǎo)時間對HUVECs氧化應(yīng)激損傷的影響。實驗發(fā)現(xiàn)AngⅡ能明顯的誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷，主要表現(xiàn)為細(xì)胞形

3、態(tài)變化，細(xì)胞器細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷，細(xì)胞活性下降，凋亡率上升，細(xì)胞脂質(zhì)過氧化增加，細(xì)胞的分泌功能如NO釋放率、eNOS、SOD活力降低。其中1μmol/L AngⅡ誘導(dǎo)12h時各項指標(biāo)為細(xì)胞活性為65.11％，NO含量43.57μmol/L，TNOS活力為6.99U/mgprot，eNOS活力為1.89 U/mgprot，MDA含量為7.46 nmol/mgprot，SOD活力為144.88U/mgprot，細(xì)胞凋亡率為(41.5±2.6)％

4、，微觀結(jié)構(gòu)顯示核膜皺縮，核仁消失，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量空泡狀結(jié)構(gòu)，線粒體或者細(xì)小或者腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張數(shù)目較少，部分核糖體丟失，平面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，但細(xì)胞未解體，仍然保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
　　(2)以芹菜苷、3-甲氧基芹菜苷標(biāo)準(zhǔn)品為研究對象，通過與建立損傷模型相同的技術(shù)考察兩者對模型的修復(fù)情況。實驗發(fā)現(xiàn)兩者均可以增加細(xì)胞活力，增加NO釋放量，清除自由基，減少細(xì)胞內(nèi)過氧化物的產(chǎn)生，降低細(xì)胞凋亡率，修復(fù)細(xì)胞器細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)等，且上述功能在芹菜苷、3-甲

5、氧基芹菜苷濃度低于50μmol/L時隨時間呈劑量依賴增加關(guān)系，高于50μmol/L時修復(fù)細(xì)胞的功效開始降低。說明兩者均具有一定程度的修復(fù)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞作用。具體結(jié)果為:50μmol/L芹菜苷修復(fù)12h時，各指標(biāo)分別為細(xì)胞活力79.07％，NO含量為139.22μmol/L，TNOS活力為26.32 U/mgprot，eNOS活力為16.32 U/mgprot，MDA含量為5.47 nmol/mgprot，SOD活力為51.51 U/mg

6、prot，細(xì)胞凋亡率下降到(14.7±1.2)％，微觀結(jié)構(gòu)顯示細(xì)胞核仁基本完整，胞漿內(nèi)空泡減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體數(shù)目未見減少，形態(tài)未見明顯病變。50μmol/L3-甲氧基芹菜苷修復(fù)12h時，各指標(biāo)分別為細(xì)胞活力64.50％，NO含量為78.88μmol/L，TNOS活力為19.94 U/mgprot，eNOS活力為12.41 U/mgprot，MDA含量為7.93 nmol/mgprot，SOD活力為44.32 U/mgprot，細(xì)胞

7、凋亡率下降到(33.7±1.7)％，微觀結(jié)構(gòu)顯示細(xì)胞器數(shù)量減少，仍有部分線粒體腫脹。說明3-甲氧基芹菜苷在一定程度上同樣具有減緩血壓癥狀的作用，其發(fā)揮作用的規(guī)律與芹菜苷類似，但效果不如芹菜苷。綜合兩者的作用效果，最終選擇50μmol/L芹菜苷修復(fù)12 h來研究芹菜苷對ERK1/2信號通路的作用。
　　(3)ERK1/2信號通路是與高血壓相關(guān)的信號通路之一。實驗發(fā)現(xiàn)，在AngⅡ誘導(dǎo)的模型中加入芹菜苷，ERK1、ERK2的mRNA表達(dá)