利用代謝工程、輔酶工程及酶工程構建重組釀酒酵母木糖利用菌株以生產乙醇的研究.pdf

1、當今世界石油能源日漸枯竭，而人類對于能源的需求又與日俱增。在這種情況下，生物乙醇作為一種無污染的可再生能源，成為了極具前途的燃料替代品之一。然而，利用玉米、高粱等富含六碳糖的谷物進行發(fā)酵生產乙醇的傳統(tǒng)方法，卻存在著與人爭糧的問題。同時，工業(yè)和農業(yè)殘余物中存在大量富含木糖等五碳糖的木質纖維素，研究如何把這些五碳糖高效的轉化為乙醇，對于解決能源以及環(huán)境問題都有著重要的意義。
　　 本實驗使用釀酒酵母Saccharomyces cer

2、evisiae作為模式生物進行了一些木糖代謝方面的研究。首先，本研究使用RT-PCR的方法對S.cerevisiae中一些組成型啟動子在木糖培養(yǎng)基中的轉錄強度進行了測量，選出了其中最強的4個啟動子pHXT17，pTPI1，pFBA1，pCCW12，并使用這4個強啟動子在不同程度上過表達來自畢赤酵母P.stipitis的木糖還原酶(XR)基因XYL1和木糖醇脫氫酶(XDH)基因XYL2以及S.cerevisiae內源的木酮糖激酶基因XKS

3、1，構建出兩株高通量的xR－XDH系統(tǒng)重組木糖代謝菌株KAM－3X(XYL1，XYL2，XKS1單啟動子表達)和KAM－6X(XYL1，XYL2，XKS1雙啟動子表達)，兩株菌均能在72h左右完全發(fā)酵50g/l的木糖，乙醇產率分別為0.280g/g和0.310g/g；同時菌株KAM－6X可以在96h內消耗完100g/l的木糖，乙醇產率為0.34g/g，而KAM-3X在相同時間內只能消耗75g/l的木糖，乙醇產率為0.32g/g。這說明，

4、隨著XYL1，XYL2，XKS1轉錄強度的增加，可以增加重組菌株的木糖消耗能力，部分降低木糖醇產率并提高乙醇產率，但是單純的增加轉錄強度并沒有從根本上解決木糖醇積累的問題。因此，需要解決XR－XDH系統(tǒng)存在的輔酶不平衡問題，才能減少副產物木糖醇的積累從而進一步增加乙醇產率。
　　 本研究對重組木糖發(fā)酵菌株KAM－6X進行混合糖發(fā)酵性能測試，結果顯示絕大部分木糖的消耗總是在葡萄糖消耗完以后才開始，而且隨著混合糖中葡萄糖濃度的升高，

5、木糖消耗速率會越來越慢。經(jīng)過后續(xù)實驗的驗證，證實這種抑制是由于葡萄糖發(fā)酵后產生的乙醇所致。
　　 為了解決由于XR－XDH系統(tǒng)造成的輔酶不平衡問題，本研究首先嘗試改變XR的輔酶偏好性。XR的2－2C12和K270R這兩種突變型，是有文獻報道的偏好NADH而不是NADPH的突變型，由于文獻中未給出實際發(fā)酵數(shù)據(jù)，因此本研究在菌株KAM－6X中引入了這兩種突變型并測量了實際發(fā)酵性能。結果顯示，2－2C12突變型嚴重影響了XR酶活，使其

6、基本無法轉化木糖；而K270R突變型雖然部分影響了XR酶活以及其木糖轉化速率，但是輔酶偏好性的轉變卻使KAM-6X(K270R)的木糖醇產率從KAM-6X的0.105g/g大幅降低到了0.026g/g，同時乙醇產率從0.297g/g提高到了0.312g/g。這證明了改變輔酶偏好性以降低副產物木糖醇的積累從而提高乙醇產率的可行性。此外，本研究直接針對輔酶系統(tǒng)本身進行改造，向重組木糖發(fā)酵菌株KAM－3X中引入了釀酒酵母內源的缺失了前導肽的N

7、ADH激酶POSS(－17)和來自乳酸乳球菌Lactococcus lactis的NADH氧化酶noxE，并測量了菌株的發(fā)酵性能。結果顯示，POS5(－17)的引入使得重組菌株的木糖醇產率與對照相比從0.177g/g上升到了0.298g/g，同時乙醇產率從0.271g/g下降到了0.213g/g，與預想的結果相反。而noxE的引入則使得重組菌株的木糖醇產率從0.191g/g大幅下降到了0.058g/g，下降達到69.93％；同時乙醇產率

8、從0.211g/g提高到了0.294g/g，增加了39.33％，達到了預期的設想。
　　 本研究通過易錯PCR的方法獲得了來自Piromyces sp的木糖異構酶基因(XI)的兩種突變型XImut5和XImut8，攜帶這兩種突變型XI的菌株，利用木糖的速度與對照相比，獲得了十分顯著的提高。對照KAM-2XKS(XI)只能在木糖培養(yǎng)基中極其緩慢的生長，無法產生乙醇，而KAM－2XKS(XImut5)和KAM－2XKS(XImut8