羊乳中摻入牛乳的免疫檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、膠體金免疫層析法作為一種快速靈敏、操作簡(jiǎn)單的免疫檢測(cè)方法，適應(yīng)于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)要求，在檢測(cè)羊乳中是否摻牛乳成分的快速檢測(cè)方法研究中有重要意義。本課題通過(guò)SDS-PAGE和native-PAGE對(duì)牛羊乳蛋白質(zhì)的區(qū)別進(jìn)行了詳細(xì)比較;選用α-CN和β-CN為免疫原進(jìn)行多克隆抗體的制備，得到的抗血清經(jīng)過(guò)鹽析和層析進(jìn)行純化;采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，優(yōu)化膠體金標(biāo)記抗體的最佳條件，標(biāo)記的鹽析IgG用于免疫層析試紙條金標(biāo)墊的包被，NC膜用鹽析Ig

2、G和羊抗兔IgG包被后，組裝后得到α-CN和β-CN膠體金試紙條，對(duì)其進(jìn)行特異性、靈敏性、檢測(cè)限測(cè)試，證實(shí)試紙條可用于羊乳中是否摻有牛乳的檢測(cè)。
　　牛羊乳蛋白質(zhì)區(qū)別比較。SDS-PAGE法條件下牛羊乳最主要的差別是酪蛋白，羊乳αs2-CN分子量大于牛乳αs2-CN分子量，羊乳αs2-CN含量較高，而牛乳αs1-CN含量較高;native-PAGE法條件下乳清蛋白分離好，羊乳有一條較大的羊乳清蛋白，而牛乳清蛋白有一條牛α-乳白蛋白

3、，最下端有兩條牛β-乳球蛋白，這是native-PAGE顯示羊乳和牛乳蛋白質(zhì)最明顯的差別。比較而言，native-PAGE更能明顯區(qū)分牛羊乳，當(dāng)羊乳中摻入5％牛乳時(shí)，在native-PAGE電泳圖譜中就可以看出明顯差異。
　　特異性多克隆抗體的制備。選用牛乳α-CN和β-CN為免疫原，對(duì)大白兔進(jìn)行免疫，其中α-CN進(jìn)行了三個(gè)濃度的免疫，采用頸動(dòng)脈取血后得到的抗血清用飽和硫酸銨分級(jí)鹽析法(50％、40％、33％)進(jìn)行粗分離，再經(jīng)過(guò)蛋

4、白A親和色譜柱得到層析抗體，經(jīng)間接ELISA檢測(cè)，制得的鹽析抗體α-CN-IgG(1)、α-CN-IgG(2)、α-CN-IgG(3)和β-CN-IgG的效價(jià)分別為1∶16000、1∶16000、1∶32000和1∶16000，層析抗體α-CN-IgG(1)、α-CN-IgG(2)、α-CN-IgG(3)和β-CN-IgG的效價(jià)分別為1∶4000、1∶8000、1∶16000和1∶8000，均具有較高效價(jià);經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，制得的

5、抗體純度達(dá)90％以上;用硫氰酸鹽法測(cè)四種抗體與抗原α-CN和β-CN的相對(duì)親和力，抗體α-CN-IgG(1)、α-CN-IgG(2)、α-CN-IgG(3)與抗原α-CN的相對(duì)親和力分別為1mol/L、1mol/L、1.5mol/L，、β-CN-IgG與抗原α-CN的相對(duì)親和力過(guò)低未測(cè)出，四種抗體α-CN-IgG(1)、α-CN-IgG(2)、α-CN-IgG(3)、β-CN-IgG與抗原β-CN的相對(duì)親和力分別為1mol/L，1.5m

6、ol/L、1.5mol/L和4.5mol/L;用間接ELISA法測(cè)抗體與羊乳的交叉反應(yīng)，四種抗體與羊乳均有一定程度的交叉反應(yīng)，且β-CN-IgG與羊乳的交叉反應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于α-CN-IgG(1)、α-CN-IgG(2)、α-CN-IgG(3)與羊乳的反應(yīng)。
　　膠體金的制備。采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金并確定制備的最佳條件為:在20mL0.01％四氯金酸溶液中加入400μL1％檸檬酸鈉溶液，持續(xù)加熱7min。通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定四種鹽析抗體

7、α-CN-IgG(1)、α-CN-IgG(2)、α-CN-IgG(3)和β-CN-IgG的最佳標(biāo)記量分別為52μL/mL、26μL/mL、52μL/mL和52μL/mL;最佳標(biāo)記pH分別是6.0-6.5、8.0、6.0-6.5和7.5-8.0。用間接ELISA法測(cè)得四種免疫膠體金活性分別為1∶600、1∶1200、1∶4800和1∶1200，與標(biāo)記前的1∶16000、1∶16000、1∶32000和1∶16000相比活性明顯降低。

8、>　　膠體金免疫層析試紙條的制備。通過(guò)試驗(yàn)優(yōu)化了試紙條金標(biāo)墊和NC膜的處理方式，并最終建立了利用β-CN試紙條或α-CN試紙條檢測(cè)羊乳中是否摻入牛乳的試驗(yàn)方法。對(duì)于β-CN試紙條，其金標(biāo)墊的最佳處理是用金標(biāo)抗體β-CNIgG-羊乳復(fù)合物溶液原液包被;NC膜C線用濃度為250mg/mL的羊抗兔IgG包被1.5μL;T線用十倍稀釋的鹽析β-CNIgG包被4μL。其對(duì)純品β-CN的靈敏性為31.25μg/mL，羊乳中摻入牛乳的檢測(cè)限為5％。對(duì)

9、于α-CN試紙條，其金標(biāo)墊的最佳處理是用金標(biāo)抗體α-CNIgG(3)-羊乳復(fù)合物溶液原液包被;NC膜C線用濃度為250mg/mL的羊抗兔IgG包被1.5μL;T線用十倍稀釋的鹽析α-CNIgG包被4μL。其對(duì)純品α-CN的靈敏性為62.5μg/mL，羊乳中摻入牛乳的檢測(cè)限為10％。
　　通過(guò)比較研究牛羊乳蛋白質(zhì)的差別，為基于乳源蛋白質(zhì)的免疫分析方法提供了依據(jù)。以牛β-CN和α-CN為抗原制備多克隆抗體，制備研制的免疫膠體金試紙條可