畢赤酵母GS115菌株FLD1啟動(dòng)子的克隆與功能分析.pdf

1、畢赤酵母FLD1基因編碼甲醛脫氫酶，它是在甲醇作為碳源和能源、甲胺為氮源時(shí)進(jìn)行代謝過(guò)程中主要的酶，畢赤酵母中FLD1啟動(dòng)子能單獨(dú)被甲醇為單一碳源(硫酸胺為氮源)或甲胺為單一氮源(葡萄糖為碳源)強(qiáng)烈誘導(dǎo)，有葡萄糖的時(shí)候甲醇也能夠誘導(dǎo)PFLD1，用甲醇和甲胺一起誘導(dǎo)PFLD1，能達(dá)到最高表達(dá)水平.用甲胺作為氮源以及山梨糖醇為碳源的誘導(dǎo)就逐漸形成了無(wú)甲醇培養(yǎng)基基質(zhì)，并解決了與PAOX1相關(guān)聯(lián)的問(wèn)題。
　　 FLD1啟動(dòng)子的啟動(dòng)表達(dá)是在

2、轉(zhuǎn)錄水平控制的，并且能達(dá)到與PAOX1相當(dāng)水平的轉(zhuǎn)錄效率和強(qiáng)調(diào)節(jié)。這些性能使得PFLD1成為一種受人關(guān)注的可選擇啟動(dòng)子，以用于畢赤酵母中外源基因的表達(dá)。
　　 根據(jù)在EMBL的登錄號(hào)AR533312保存的FLD1啟動(dòng)子序列，我們合成了兩條引物，并且以畢赤酵母GS115基因組DNA為模板，由PCR擴(kuò)增出了FLD1啟動(dòng)子的序列。
　　 測(cè)序分析表明，擴(kuò)增的序列分別在-30和-445位置有單堿基突變。通過(guò)誘發(fā)分子突變的方法使突

3、變序列變回到野生型。
　　 用綠色熒光蛋白基因作為報(bào)告基因，我們各自在雙表達(dá)盒的載體上評(píng)價(jià)突變型和野生型FLD1啟動(dòng)子序列的功能，一個(gè)表達(dá)盒處于PAOX1下面，另一個(gè)則是GFP表達(dá)盒，在我們的FLD1啟動(dòng)子控制下。
　　 通過(guò)把帶有克隆體的酵母菌株培養(yǎng)到7個(gè)試驗(yàn)培養(yǎng)基中來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)兩個(gè)PFLD1功能以及它們?cè)陔p表達(dá)盒載體上的能力做了對(duì)比。
　　 這7個(gè)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基分別包含以下的碳源和氮源：(1)葡萄糖和銨鹽(G/