內(nèi)皮型一氧化氮合酶運(yùn)輸誘導(dǎo)物的表達(dá)在妊娠期高血壓疾病發(fā)病機(jī)制中的作用的實(shí)驗研究.pdf

1、第一部分妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中內(nèi)皮型一氧化氮合酶運(yùn)輸介導(dǎo)物表達(dá)的研究 目的:通過測定妊娠期高血壓疾病孕婦胎盤組織中內(nèi)皮型一氧化氮合酶運(yùn)輸介導(dǎo)物(NOSTRIN)及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達(dá)，探討NOSTRIN在妊娠期高血壓疾病發(fā)病中的作用機(jī)制。 方法:逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測23例妊娠期高血壓疾病患者(病例組)和17例正常晚孕婦女(正常組)胎盤組織中NOSTRINmRNA的表達(dá)；West

2、ernblot檢測胎盤組織中NOSTRIN和eNOS蛋白質(zhì)的表達(dá)；免疫組化染色法檢測胎盤組織中NOSTRIN的表達(dá)，通過高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)對其定量分析；HE染色觀察胎盤絨毛血管病變；分光光度法測定胎盤組織中eNOS的活性；硝酸還原酶法測定胎盤組織中和外周血中的NO代謝產(chǎn)物亞硝酸基/亞硝基(NO2-/NO3-)。 結(jié)果:病例組胎盤組織中NOSTRINmRNA呈強(qiáng)表達(dá)，明顯高于正常組(P＜0.01)；Westernblot

3、顯示兩組胎盤組織中均有58kDa的NOSTRIN蛋白質(zhì)表達(dá)，但病例組表達(dá)量明顯增高(P＜0.01)，同時也均有145kDa的eNOS蛋白質(zhì)表達(dá)，兩組比較表達(dá)量無差異(P＞0.05)；免疫組化染色定量分析發(fā)現(xiàn)，NOSTRIN在病例組胎盤組織中的表達(dá)明顯高于正常組(P＜0.01)；HE染色可見病例組胎盤細(xì)小血管壁增厚，管壁纖維素樣壞死發(fā)生率顯著高于正常組(P＜O.01)；病例組患者胎盤組織eNOS活性(13.727±3.58U/mg)與正常

4、組(21.69±3.84U/mg)比較降低顯著(P＜0.01)；病例組孕婦胎盤組織中的NO2-/NO3-(27.53±7.48μmol/mg)與正常組(54.27±9.53μmol/mg)比較顯著降低(P＜0.01)；病例組孕婦外周血清NO2-/NO3-(38.56±8.49μmol/l)與正常組(65.37±9.61μmol/l)比較顯著降低(P＜0.01)；病例組胎盤組織中NOSTRN表達(dá)水平與eNOS活性呈負(fù)相關(guān)(r=-0.57，

5、P＜0.01)。 結(jié)論:妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中NOSTRIN表達(dá)水平明顯升高，eNOS活性降低，這可能在妊娠期高血壓疾病的發(fā)病中起重要作用。 第二部分NOSTRIN基因克隆及其在HUVEC中的表達(dá) 目的:構(gòu)建內(nèi)皮型一氧化氮合酶運(yùn)輸介導(dǎo)物(endothelialnitricoxidesynthasetrafficinducer,NOSTRIN)基因的真核表達(dá)載體，通過質(zhì)粒用NOSTRIN真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人

6、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC)獲得高表達(dá)NOSTRIN基因的細(xì)胞克隆。 方法:以質(zhì)粒pcDNA3.1為載體，將NOSTRINcDNA插入后得到NOSTRIN真核表達(dá)載體。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入體外培養(yǎng)的HUVEC，Westernblot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中NOSTRIN蛋白質(zhì)的表達(dá)。 結(jié)果:酶切電泳和基因測序證實(shí)，成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcD

7、NA3.1-NOSTRIN。并用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法獲得了高穩(wěn)定表達(dá)NOSTRIN的細(xì)胞克隆；Westernblot顯示轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞均有58KD的蛋白質(zhì)表達(dá)，轉(zhuǎn)染后表達(dá)量明顯增高。 結(jié)論:重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NOSTRIN經(jīng)轉(zhuǎn)染能在HUVEC細(xì)胞中高效表達(dá)，為進(jìn)一步研究NOSTRIN對HUVEC的生物學(xué)影響奠定了基礎(chǔ)。 第三部分NOSTRIN基因高表達(dá)誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生物活性改變的研究 目的:研究人內(nèi)皮型

8、一氧化氮合酶運(yùn)輸介導(dǎo)物(endothelialnitricoxidesynthasetrafficinducer,NOSTRIN)基因在體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVEC)中的過度表達(dá)對該細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。 方法:脂質(zhì)體法將pcDNA3.1-NOSTRIN真核表達(dá)載體及空載體分別轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HUVEC，并設(shè)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對照組，G418篩選陽性克隆。免

9、疫組織化學(xué)法檢測NOSTRIN的表達(dá)部位及FⅧRAg的表達(dá)；Westernblot檢測上述處理細(xì)胞中NOSTRIN和eNOS蛋白質(zhì)的表達(dá)；分光光度法和硝酸還原酶法分別測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中eNOS的活性和NO代謝產(chǎn)物亞硝酸基/亞硝基(NO2-/NO3-)水平；光鏡、電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果:免疫組織化學(xué)證實(shí)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞均為血管內(nèi)皮來源細(xì)胞，三組均在細(xì)胞膜和胞漿表達(dá)NOSTRIN；Westernblot顯示細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后均表

10、達(dá)58KD的NOSTRIN，但轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NOSTRIN后表達(dá)量明顯增高，同時也均有145KD的eNOS蛋白質(zhì)表達(dá)，表達(dá)量無差異(P＞0.05)；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NOSTRIN細(xì)胞培養(yǎng)上清eNOS活性(11.727±3.09U/ml)與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(22.69±3.36U/ml)和對照組細(xì)胞(21.85±3.47U/ml)比較降低顯著(P＜0.01)，同時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NOSTRIN細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO2-/NO3-

11、為(25.56±2.49μmol/l)，與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(48.37±2.61μmol/l)和對照組(49.06±2.78μmol/l)比較顯著降低(P＜0.01)；光鏡和電鏡觀察看到轉(zhuǎn)染NOSTRIN后對HUVEC有損傷作用(HUVEC拉長、微絨毛變短、細(xì)胞膜損傷，胞漿內(nèi)有脂滴空泡，核膜不完整)。 結(jié)論:NOSTRIN的高表達(dá)影響了HUVEC的生物學(xué)特性，對HUVEC有明顯的損傷作用，這可能是妊娠期高血壓疾病發(fā)病重要環(huán)節(jié)之一。

12、 第四部分TNF-a上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中NOSTRIN基因的表達(dá) 目的:探討腫瘤壞死因子-a(TNF-a)對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)皮型一氧化氮合酶運(yùn)輸介導(dǎo)物(NOSTRIN)基因表達(dá)的調(diào)控作用。 方法:將培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞分為3組：1組為用妊娠期高血壓疾病患者(HDCP)血清作用的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，2組為用正常晚孕婦女血清作用的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，3組為無任何處理的HUVEC。用逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)檢測兩組細(xì)胞中NOSTRI

13、NmRNA的表達(dá)。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(ELISA)檢測HDCP患者和正常孕婦血清中TNF-a含量。用1ng/ml、3ng/ml、5ng/ml3種濃度的TNF-a分別作用HUVEC細(xì)胞株6h，以及用濃度為3ng/ml的TNF-a作用HUVEC細(xì)胞分別長達(dá)6h、12h、24h，逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測NOSTRINmRNA的表達(dá)；將二硫代氨基甲酸吡硌烷(PDTC，5mmol/ml)與TNF-a(3ng/ml)同時作用以及TNF

14、-a(3ng/ml)單獨(dú)作用HUVEC細(xì)胞6h，RT-PCR檢測NOSTRIN基因mRNA的表達(dá)。 結(jié)果:三組細(xì)胞中都有NOSTRIN表達(dá)，1組表達(dá)量顯著高于2組和3組(P＜0.01)。ELISA結(jié)果顯示，HDCP患者血清中TNF-a含量顯著高于正常晚孕婦女(P＜0.01)。TNF-a作用HUVEC細(xì)胞后NOSTRIN表達(dá)顯著高表達(dá)，并成時間和劑量依賴關(guān)系(P＜0.01)。PDTC和TNF-a同時作用的HUVEC和TNF-a單獨(dú)