基于通用抗體檢測伐地那非(及其類似物)和氟喹諾酮總量兩種免疫學(xué)方法的研究.pdf

1、第一部分、基于通用抗體檢測伐地那非及其類似物
　　 免疫學(xué)方法的研究：
　　 磷酸二酯酶-5(Phosphodiesterase-5,PDE-5)是特異性水解環(huán)磷酸鳥苷的酶。通過抑制劑PDE-5,能夠提高陰莖海綿體中環(huán)磷酸鳥苷的含量,導(dǎo)致陰莖動(dòng)脈及陰莖海綿體的平滑肌舒張從而獲得治療陽痿的效果。
　　 鹽酸伐地那非(Levitra,拜爾)是一種獲US-FDA批準(zhǔn)用于治療陽痿的PDE-5抑制劑藥物。近年來,違法添加到

2、保健品和植物藥品的伐地那非及其類似物對公眾的健康構(gòu)成了威脅。不當(dāng)使用伐地那非會導(dǎo)致頭痛、面部潮紅、消化不良、視力模糊和肌肉酸痛等副作用。如果病人在服用硝酸酯藥物的同時(shí)服用含伐地那非的保健品將會造成致命的低血壓。已經(jīng)有兩種文獻(xiàn)報(bào)道的伐地那非結(jié)構(gòu)類似物,其結(jié)構(gòu)式中的發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)是伐地那非及其類似物的共有結(jié)構(gòu)。伐地那非類似物具有更強(qiáng)的代謝穩(wěn)定性和脂溶性,能夠在體內(nèi)長時(shí)間維持高血藥濃度,并更容易通過血腦屏障產(chǎn)生中樞神經(jīng)傷害。因此,必須加強(qiáng)對伐地那

3、非結(jié)構(gòu)類似物的監(jiān)管和篩查。
　　 目前,檢測伐地那非的主要有HPLC、LC-MS、GC-MS和LC-ESI-MS/MS等儀器檢測方法,雖然靈敏、精確和可靠,但需要昂貴設(shè)備且運(yùn)行費(fèi)用高,難以在基層工作中大規(guī)模開展。本研究通過制備以伐地那非及其類似物共同基團(tuán)為主要抗原位點(diǎn)的人工抗原,獲得了能夠同時(shí)檢測伐地那非及其類似物的通用抗體,并建立了同時(shí)檢測伐地那非及其類似物的免疫學(xué)方法。結(jié)果如下:
　　 1.使用戊二醛利用親電取代反應(yīng)

4、原理,合成突出伐地那非及其類似物共同基團(tuán)的人工抗原;用免疫抗原免疫動(dòng)物,并利用雜交瘤技術(shù)篩選得到能夠識別伐地那非及其類似物的通用單克隆抗體(Genenc Monoclonal Antibody);
　　 2.建立了同時(shí)檢測伐地那非及其類似物的免疫學(xué)檢測方法。對伐地那非的檢測限為5.0ng/mL,IC50值為18.2 ng/mL;
　　 3.該系統(tǒng)檢測32個(gè)樣品種伐地那非及其類似物的結(jié)果,與HPLC的檢測結(jié)果一致無明顯差異

5、(P＜0.05)。
　　 第二部分基于通用抗體檢測(氟)喹諾酮總量
　　 免疫學(xué)方法的研究：
　　 (氟)喹諾酮是一類廣譜抗菌素,通過抑制原核生物的DNA解旋酶對革蘭氏陰性和陽性菌發(fā)揮高效殺傷作用。近年來,(氟)喹諾酮類藥物在臨床和獸醫(yī)中的廣泛應(yīng)用,還被用作食品添加劑促進(jìn)動(dòng)物的生長。這類藥物的濫用會危害公共健康(如產(chǎn)生過敏反應(yīng)、細(xì)菌耐藥性),污染環(huán)境和影響工業(yè)生產(chǎn)(如導(dǎo)致乳酪和酸奶發(fā)酵無法進(jìn)行)。因此,歐盟食品安

6、全委員會制定了動(dòng)物源食品中(氟)喹諾酮類藥物的殘留限量(96/23/EC),規(guī)定歐盟各國必須對對食品中該類藥物的殘留量進(jìn)行監(jiān)管。中國農(nóng)業(yè)部規(guī)定(氟)喹諾酮藥物在各種動(dòng)物源性食品中的殘留量不得超100μg/kg(農(nóng)業(yè)部部頒標(biāo)準(zhǔn),NO.278.2003.5.22).
　　 目前,用于該類藥物殘留檢測的方法有HPLC,LC-MS,GC-MS以及CE等?；趦x器方法的多殘留檢測需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理過程,要借助昂貴的檢測設(shè)備而且運(yùn)行費(fèi)用高

7、。而基于免疫學(xué)技術(shù)的多殘留檢測方法具有快速、靈敏、特異、價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn),很適合在基層檢測部門進(jìn)行初篩,使值得關(guān)注的一個(gè)研究方向。
　　 本研究選用環(huán)丙沙星(CPFX)連接到經(jīng)糖基化修飾的BSA作為免疫抗原,連接到OVA作為檢測抗原,把“(氟)喹諾酮藥物共同基團(tuán)突出在人工抗原的表面。使用糖基化載體能夠提高免疫抗原的免疫效果,用雜交瘤技術(shù)篩選對(氟)喹諾酮藥物共同基團(tuán)的通用單克隆抗體,用于開發(fā)檢測(氟)喹諾酮該類抗菌素的多殘留免疫檢測方

8、法。結(jié)果如下:
　　 1、采用戊二醛作為連接臂,將代表藥物環(huán)丙沙星連接到不同的載體蛋白制備突出(氟)喹諾酮類藥物共同基團(tuán)的免疫抗原和檢測抗原。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)采用糖基化BSA作為載體蛋白制備免疫抗原,能夠提高免疫原性并獲得更好的動(dòng)物免疫效果;
　　 2、應(yīng)用雜交瘤技術(shù),篩選并鑒別到一株能識別多種(氟)喹諾酮類藥物的通用單克隆抗體,以環(huán)丙沙星為代表藥物繪制競爭抑制曲線,50％競爭抑制的CPFX濃度(IC50)為10.2 ng/m

9、L,最低檢測限度為1.0 ng/mL,線性范圍在1.0-27ng/mL。對其他10種常用的(氟)喹諾酮類藥物的交叉反應(yīng)率在7.2-96.2％;
　　 3、分別在20個(gè)雞肝和20個(gè)雞蛋中添加50、100、150 ng/g的環(huán)丙沙星,采用本研究開發(fā)的樣品處理和ELISA方法檢測,加標(biāo)回收率在64.0-91.8％之間,批內(nèi)差異在8.7-12.5％。
　　 4、采用本研究開發(fā)的樣品處理和ELISA方法,對20個(gè)雞肝和20個(gè)雞蛋樣