Smad對樹突狀細胞TGF-β信號傳導(dǎo)影響機制的初步研究.pdf

1、第一部分、 HDM刺激小鼠肺SMAD蛋白表達
　　 目的：探討屋塵螨（HDM）氣道刺激后，不同遺傳背景小鼠肺組織SMAD蛋白表達有何不同。
　　 方法：將A/J和C3H小鼠分別用HDM氣道刺激，在最后一次刺激16小時后，取肺組織，經(jīng)過勻漿處理，提取核蛋白，用western blot免疫印跡法檢測肺組織蛋白中Smad2/3、Smad6的表達。
　　 結(jié)果：A/J和C3H小鼠在HDM氣道刺激16小時后，肺組織Smad

2、6蛋白表達差異明顯，表現(xiàn)為A/J小鼠Smad6升高，而C3H則呈現(xiàn)于A/J相反得變化，Smad6表達降低，而Smad2/3表達則正好相反，A/J降低，C3H增高。
　　 結(jié)論：經(jīng)HDM氣道刺激后，不同遺傳背景小鼠Smad表達有所差異，需要進一步研究驗證其在TGF-β信號傳導(dǎo)中的作用。
　　 第二部分、針對小鼠Smad6基因的RNA干擾
　　 目的：針對目的基因Smad6 CDS區(qū)設(shè)計siRNA序列，構(gòu)建表達載體，

3、探討感染后BMDC細胞中Smad6基因和蛋白表達狀況。
　　 方法：針對目的基因Smad6 CDS區(qū)設(shè)計三條siRNA序列，分別為siRNA1、siRNA2、siRNA3，使用siRNA質(zhì)粒表達載體pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector進行siRNA表達載體構(gòu)建，對構(gòu)建成功的siRNA重組表達載體進行去內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA抽提，siRNA重組表達載體DNA轉(zhuǎn)染L929細胞，然后Real-time PCR的方法檢測基

4、因干預(yù)后L929細胞中Smad6基因表達狀況，使用Lentivirus Pakagesysterm進行慢病毒顆粒的包裝和生產(chǎn)，測定病毒滴度（梯度稀釋法），再分離C3H/HeJ小鼠骨髓原代BMDC，獲取最佳MOI值以及感染條件，后用慢病毒感染BMDC細胞，RT-PCR和western blot分別檢測感染后細胞中Smad6基因的表達及SMAD6蛋白表達狀況。
　　 結(jié)果：Real Time-PCR檢測結(jié)果顯示，siRNA1對于Sm

5、ad6基因的沉默效果最好，沉默效率約為67％?？紤]到細胞大約75％的轉(zhuǎn)染效率，實際的基因沉默可能達到90％（mRNA），最佳MOI值為20，RealTime-PCR檢測結(jié)果顯示，通過病毒載體感染BMDC細胞，提示siRNA1對于Smad6基因的沉默效約為85％，而BMDC中蛋白表達被明顯抑制，與對照組有差異有顯著性。
　　 結(jié)論：我們針對目的基因Smad6 CDS區(qū)所設(shè)計的siRNA序列而構(gòu)建的表達載體能成功有效抑制Smad6基