單側(cè)前牙反牙合導(dǎo)致顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎改變的動(dòng)物模型構(gòu)建.pdf

1、顳下頜關(guān)節(jié)（temporomandibular joint,TMJ）是OA(osteoarthritis)發(fā)生的最常見(jiàn)部位之一，也是顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病TMD的重癥表現(xiàn)形式之一。TMJ的功能運(yùn)動(dòng)和生物機(jī)械力與咬合的關(guān)系相當(dāng)密切，而異常咬合被認(rèn)為是TMJ OA的潛在病理因素。最近我課題組分別報(bào)道了在大鼠和小鼠上下前牙上安裝一種金屬不良修復(fù)體導(dǎo)致動(dòng)物單側(cè)前牙反牙合（unilateral anterior crossbite,UAC），從而誘導(dǎo)出

2、TMJ OA的病損。本研究旨在前期工作基礎(chǔ)上進(jìn)一步從從影像學(xué)（運(yùn)用micro-CT）、大體觀察（用體視顯微鏡）、組織學(xué)研究（HE染色和番紅O/固綠染色）、超微結(jié)構(gòu)觀察（用透射電鏡）以及相關(guān)基因的mRNA水平變化（用real-time PCR）等方面對(duì)TMJ OA病損的發(fā)生和發(fā)展以及性別差異等多方面對(duì)我們單側(cè)前牙反牙合動(dòng)物模型進(jìn)行全面系統(tǒng)的評(píng)價(jià)。
　　第一部分大鼠單側(cè)前牙反牙合模型的建立和標(biāo)本的收集、以及髁狀突表面的大體形態(tài)學(xué)觀察結(jié)

3、果
　　目的：建立單側(cè)前牙反牙合動(dòng)物模型，用體視顯微鏡對(duì)髁狀突表面進(jìn)行大體宏觀觀察。方法：由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供120只6周齡Sprague-Dawley（SD）大鼠，分別為雌性60只（體重140-160g），雄性60只（150-170g）。所有對(duì)大鼠的飼養(yǎng)和操作規(guī)程均得到第四軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)的許可，并嚴(yán)格遵循其規(guī)章制度執(zhí)行，按照一定的規(guī)格制作大鼠左側(cè)上下切牙金屬套筒冠，其中左下切牙的金屬套筒冠有一與其長(zhǎng)軸呈135度唇向傾斜

4、的平面導(dǎo)板。這樣，實(shí)驗(yàn)組（UAC組）大鼠左側(cè)切牙呈反向咬合，而右側(cè)切牙咬合正常。而對(duì)照組采用同樣的處理方法和飼養(yǎng)條件，但不粘結(jié)左上下切牙的金屬套筒冠，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。分別在UAC手術(shù)后4、12、20周后，對(duì)這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的大鼠TMJ進(jìn)行取材，用來(lái)進(jìn)行micro-CT掃描、大體觀察、組織化學(xué)染色、透射電鏡觀察以及相關(guān)基因的mRNA水平檢測(cè)等。大體觀察方法：將髁狀突頭從TMJ關(guān)節(jié)囊中脫出，剝離周?chē)浗M織，用冠剪從其髁狀突頸部剪下髁狀突頭，立即放

5、入0.9％生理鹽水中，編上編號(hào)，馬上在體視顯微鏡下進(jìn)行觀察及拍照，并按照一定的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每個(gè)髁狀突進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果：雌雄動(dòng)物的對(duì)照組髁狀突軟骨表面大多呈光滑連續(xù)、豐滿(mǎn)的梭形。4周時(shí)，UAC組髁狀突表面變?yōu)槭蓍L(zhǎng)的梭形；12周時(shí)，UAC組髁狀突表面出現(xiàn)輕微變形、中部出現(xiàn)明顯的淺凹陷；而到20周時(shí)，中部的凹陷更嚴(yán)重，致使髁狀突表面呈“葫蘆狀”或“8字形”的變形。
　　結(jié)論：UAC使大鼠髁狀突出現(xiàn)變形，并且這種變形隨著時(shí)間的推移

6、而加重。
　　第二部分 Micro-CT對(duì)髁狀突軟骨下骨進(jìn)行影像學(xué)研究
　　目的：用來(lái)掃描、評(píng)估UAC導(dǎo)致大鼠髁軟骨下骨的長(zhǎng)程變化。
　　方法：在髁狀突軟骨下骨的中部和后部選擇兩個(gè)圓柱體（長(zhǎng)軸0.5mm，直徑0.25mm）作為感興趣區(qū)，在此感興趣區(qū)內(nèi)，用Mimics16.0對(duì)BV/TV（骨體積分?jǐn)?shù)），BS/BV(骨表面積和骨體積之比)，Tb.Th(骨小梁厚度)、Tb.Sp（骨小梁間隙）、Tb.N（骨小梁數(shù)量）進(jìn)行計(jì)算，

7、然后取兩者的平均值作為最終統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果：雌雄動(dòng)物4、12、20周UAC組的BV/TV值均低于其各自的同齡對(duì)照組。雌雄動(dòng)物UAC組4周和12周的TB.SP值均高于各自的同齡對(duì)照組。雌性動(dòng)物4周和12周的BS/BV值均高于各自的同齡對(duì)照組。而雄性動(dòng)物只有4周時(shí)，其UAC組BS/BV高于其對(duì)照組。雌性動(dòng)物12周和20周時(shí)，UAC組的Tb.Th值均高于各自的同齡對(duì)照組，而雄性動(dòng)物只有在20周時(shí)，其UAC組Tb.Th高于其對(duì)照組。雄

8、性動(dòng)物4周和12周UAC組的TB.N值均低于各自的同齡對(duì)照組。而雌性動(dòng)物只有在4周時(shí)，其UAC組的TB.N數(shù)值低于其對(duì)照組。
　　結(jié)論：UAC導(dǎo)致三個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組大鼠髁狀突軟骨下骨骨質(zhì)丟失，但這種骨質(zhì)丟失的幅度隨著時(shí)間的推移而逐漸減弱。
　　第三部分組織化學(xué)染色及組織學(xué)評(píng)分
　　目的：用組織化學(xué)染色對(duì)TMJ進(jìn)行觀察和評(píng)分。
　　方法：常規(guī)HE染色和番紅O/固綠染色。
　　結(jié)果：雌雄動(dòng)物在4、12和20周UA

9、C組其組織學(xué)評(píng)分均高于各自的同齡對(duì)照組，并且其評(píng)分隨著時(shí)間的推移而增加。而無(wú)論雌雄，其4周UAC和12周對(duì)照組相比、12周UAC組和20周對(duì)照組相比，組織學(xué)評(píng)分均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：UAC導(dǎo)致大鼠TMJ髁狀突評(píng)分增加，并且其增加趨勢(shì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。UAC導(dǎo)致大鼠TMJ評(píng)分增加的趨勢(shì)類(lèi)似于提前老化。
　　第四部分透射電鏡對(duì)髁狀突軟骨進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察
　　目的：觀察UAC刺激導(dǎo)致髁狀突軟骨出現(xiàn)的超微結(jié)果變化。<

10、br>　　方法：用2.5%的戊二醛和1%的四氧化鋨固定髁狀突軟骨標(biāo)本，10%EDTA脫鈣，用水漂洗后，梯度乙醇脫水、氧化丙烯處理、環(huán)氧樹(shù)脂812過(guò)夜。之后，在60℃烤箱中固化。用顯微鏡超薄切片機(jī)超薄切片處理，用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛對(duì)切片進(jìn)行染色后用透射電鏡進(jìn)行觀察。
　　結(jié)果：雌雄動(dòng)物UAC組髁狀突軟骨中都出現(xiàn)了排列紊亂的膠原纖維和纖維間隙的擴(kuò)大、軟骨細(xì)胞周?chē)}化痕跡的增多。另外，雌性UAC組髁狀突軟骨增殖層細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的自噬泡

11、，并且隨著時(shí)間的推移而逐漸增多。
　　結(jié)論：UAC導(dǎo)致雌雄大鼠髁狀突軟骨出現(xiàn)膠原纖維稀疏、排列紊亂、軟骨細(xì)胞周?chē)|(zhì)鈣化增強(qiáng)、雌性動(dòng)物中自噬泡的大量出現(xiàn)等，這些結(jié)果顯示雄性的超微結(jié)構(gòu)的變化沒(méi)有雌性明顯。
　　第五部分髁狀突軟骨的 mRNA水平檢測(cè)
　　目的：檢測(cè)相關(guān)基因在UAC所致髁狀突軟骨退變中的變化，初步探討TMJ OA的病理機(jī)制。
　　方法：用來(lái)自于兩只大鼠TMJ的髁狀突軟骨組織（n=2）進(jìn)行RNA提取，反

12、轉(zhuǎn)后進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)和分析。這樣共進(jìn)行三次，每次對(duì)來(lái)自?xún)芍徊煌笫骉MJ髁狀突軟骨組織（n=2）進(jìn)行RNA提取、real-time PCR檢測(cè)。取三次檢測(cè)結(jié)果的均值作為最終統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果：和各自的同時(shí)間點(diǎn)同齡對(duì)照相比，Aggrecan和Col2a1的mRNA水平在4、12和20周的雌雄UAC組中均呈下降趨勢(shì)。在雌性UAC組中，Adamts-4和
　　Adamts-5，在4周時(shí)與同時(shí)間點(diǎn)同齡對(duì)照相比升高

13、，而在12周和20周時(shí)與同時(shí)間點(diǎn)同齡對(duì)照相比降低。而在雄性UAC組，Adamts-4和Adamts-5在4周時(shí)比同時(shí)間同齡對(duì)照相比呈升高趨勢(shì)；而在12周時(shí)與同時(shí)間點(diǎn)同齡對(duì)照相比呈降低趨勢(shì)（p=0.003，p=0.002）；但在20周時(shí)，與同時(shí)間點(diǎn)同齡對(duì)照相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Mmp3在雌雄動(dòng)物4、12和20周，其UAC組的mRNA表達(dá)量均高于各自同時(shí)間點(diǎn)的同齡對(duì)照。Mmp13在4周雌雄UAC組與同時(shí)間同齡對(duì)照相比呈增高趨勢(shì)，在12周的雌雄U

14、AC組與同時(shí)間的同齡對(duì)照相比呈降低趨勢(shì)，在20周雌性UAC組與同時(shí)間點(diǎn)同齡對(duì)照相比呈降低趨勢(shì)，而在雄性動(dòng)物中則呈與同時(shí)間點(diǎn)同齡對(duì)照相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與各自的同時(shí)間同齡對(duì)照組相比，雌雄4周UAC組的Col10mRNA水平均呈增加趨勢(shì)，而在12周和20周UAC組中呈減少趨勢(shì)。Alp的mRNA表達(dá)水平在雌雄4周UAC組均高于各自的同時(shí)間點(diǎn)同齡對(duì)照組，而在12周和20周的UAC組中均低于各自同時(shí)間點(diǎn)的同齡對(duì)照組。與同時(shí)間點(diǎn)同齡對(duì)照相比，Run