腫瘤特異性MAGE-A3基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、腫瘤嚴(yán)重危害現(xiàn)代人類的健康及生命,特別是惡性腫瘤,具有很高的致死率.目前人們對腫瘤的治療主要依靠外科手術(shù)以及放療、化療等,近年來以腫瘤生物學(xué)特性為出發(fā)點(diǎn)研究新的腫瘤治療方法成為了一個(gè)重要的研究方向,基因免疫治療就是其中的熱點(diǎn)之一. 腫瘤基因免疫治療具有腫瘤高度特異性的特點(diǎn),對正常細(xì)胞及組織幾乎不產(chǎn)生損傷.它依賴于細(xì)胞免疫和體液免疫兩大免疫系統(tǒng)的活化,而保證免疫治療成功的關(guān)鍵是發(fā)現(xiàn)并鑒定腫瘤特異性抗原. 黑色素瘤相關(guān)抗原3

2、 (Melanoma-associated antigens 3,MAGE-3、MAGE-A3)作為人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并鑒定的腫瘤特異性抗原,廣泛表達(dá)于人體的多種腫瘤組織及細(xì)胞,如黑色素瘤、頭頸部鱗癌、肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等等.MAGE-A3基因在其他正常的組織中均不表達(dá),除了睪丸生殖細(xì)胞.但是睪丸生殖細(xì)胞因?yàn)椴槐磉_(dá)MHC-Ⅰ/Ⅱ類分子因而不能遞呈MAGE抗原蛋白,所以MAGE-A3基因編碼抗原蛋白的表達(dá)不會引起免疫系統(tǒng)對睪丸組織的損害.

3、基于這些發(fā)現(xiàn),人們對將MAGE-A3用于特異性的抗腫瘤免疫治療產(chǎn)生了濃厚的興趣. 經(jīng)過多年的努力,人們發(fā)明的以MAGE基因?yàn)榛A(chǔ)的疫苗類型主要有:MAGE抗原肽/蛋白、表達(dá)MAGE蛋白的黑色素瘤細(xì)胞、附加了MAGE抗原肽或者基因的樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cells,DCs)等等.蛋白疫苗的特點(diǎn)是含有己知和未知的CD8<'+>T細(xì)胞表位和CD4<'+>T細(xì)胞表位,不被特定的HLA表型所限制,既可通過MHC-Ⅰ類分子途徑,又

4、可通過MHC-Ⅱ類分子途徑激活抗腫瘤免疫應(yīng)答,因此采用蛋白疫苗可能具有更大的臨床應(yīng)用意義.本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR方法從舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113中擴(kuò)增出MAGE-A3全長蛋白編碼序列,并將其克隆到原核表達(dá)載體pET-32a中構(gòu)建出pET-32a/MAGE-A3重組載體,為進(jìn)一步對重組載體的抗原蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物在體內(nèi)外特異性誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicity Tlymphocyte,CTL)殺傷活性的研究提供實(shí)驗(yàn)依

5、據(jù). 方法:1、網(wǎng)上查詢獲得MAGE-A3基因序列,確定其編碼蛋白質(zhì)的序列全長.2、設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增編碼蛋白質(zhì)的目的片段,同時(shí)參照質(zhì)粒載體pET-32a的圖譜在引物兩端分別增加酶切位點(diǎn)Sac Ⅰ和Xho Ⅰ.3、復(fù)蘇、培養(yǎng)舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113,收集細(xì)胞,通過RT-PCR擴(kuò)增出目的片段,目的片段切膠回收.4、回收目的片段通過TA克隆進(jìn)行轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增,酶切鑒定,重組載體測序,并與網(wǎng)上序列比對同源性.5、用Sac Ⅰ和Xho Ⅰ核酸內(nèi)

6、切酶雙酶切重組T載體和pET-32a質(zhì)粒載體,進(jìn)行連接,從而構(gòu)建pET-32a/MAGE-A3原核表達(dá)重組質(zhì)粒. 結(jié)果:1、通過RT-PCR可以從舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113中擴(kuò)增出目的片段.2、通過TA克隆可以獲得成功轉(zhuǎn)化的重組T載體,測序結(jié)果與網(wǎng)上序列有很高的同源性,并且未出現(xiàn)提前終止密碼子.3、通過雙酶切重組T載體和pET-32a質(zhì)粒載體可以將目的片段與pET-32a質(zhì)粒載體重組,構(gòu)建出重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a/MAG