乳鏈菌腫瘤特異性標記系統(tǒng)及跨界thyA同源重組載體的構(gòu)建.pdf

1、研究背景：
　　腫瘤標志物在臨床上已應用了許多年，對腫瘤的早期診斷及后續(xù)療效觀察起了重要作用。但傳統(tǒng)的腫瘤標記物特異性不高，在某些良性非腫瘤疾病也會引起假陽性。此外，大部分腫瘤標記物只局限于某一種或幾種特定組織類型的腫瘤而不能廣泛作用于不同組織類型的腫瘤。為了提高檢查準確性及全面性，臨床上常將多種標志物組成聯(lián)合標志物組，對不同組織類型的腫瘤應用不同的聯(lián)合標志物組進行檢測，作為篩查手段經(jīng)濟投入大，不符合成本-效益原則。
　　研

2、究發(fā)現(xiàn)PEG-3（progression elevated gene-3）是一種針對廣泛腫瘤特征的啟動子，能特異性識別多種惡性腫瘤細胞，而不對正常細胞產(chǎn)生影響，具有很好的靶向性。國內(nèi)外關(guān)于PEG-3介導外源性基因表達的研究大多采用病毒載體。雖然能使基因高水平導入和表達，但所引發(fā)的宿主炎性免疫反應較強，生產(chǎn)成本亦甚高，最重要的是病毒載體具有潛在危險性。
　　研究表明,通過“菌感”的方法可安全有效地利用細菌介導外源性基因進入細胞。即把

3、侵襲素（Inv）與溶血素（hly）基因結(jié)合,就能使不具備侵襲能力的細菌進入非吞噬哺乳動物細胞，并在細胞內(nèi)表達所需之目的基因。這種“菌感”的方式已在大腸桿菌和金葡菌上進行過試驗,乳鏈菌被認為是一種對人體無害（generally regarded as safe, GRAS）的食品級的細菌，是作為“菌感”菌的最佳選擇。但傳統(tǒng)的乳鏈菌載體以紅霉素或氯霉素等抗性基因作為選擇標志，存在使抗生素抗性播散的危險。使用不帶有抗性標記的thyA營養(yǎng)缺陷型

4、細菌，具有更高的生物安全性。腸道有一定濃度的胸腺嘧啶核苷酸, thyA缺陷乳鏈菌能定植于腸道發(fā)揮作用。但thyA缺陷株不能在外界環(huán)境中生長，從而避免了包括“菌感”基因、抗性基因在內(nèi)的外源基因發(fā)生水平轉(zhuǎn)移的危險。
　　如果我們將跨界重組thyA缺陷型乳鏈菌與腫瘤特異性標記系統(tǒng)相結(jié)合，就能使“菌感”菌侵入哺乳動物細胞，在腫瘤細胞表達和分泌綠色熒光蛋白，實現(xiàn)腫瘤的靶向標記?？梢暬土炕[瘤細胞，不僅有助于檢測腫瘤，還可用于術(shù)前分級，術(shù)中

5、處理及術(shù)后監(jiān)測。此外，還為將來進行基因靶向治療奠定基礎，具有廣闊的應用前景。
　　研究目的：
　　1.利用乳鏈菌穿梭質(zhì)粒pTRKH2構(gòu)建PEG-3啟動子介導的腫瘤特異性標記系統(tǒng)，并驗證其腫瘤特異性標記能力。
　　2.根據(jù)細菌thyA營養(yǎng)缺陷型和雙交叉同源重組的原理，構(gòu)建一個含thyA基因的上、下游同源臂、inv基因及hly基因的同源重組質(zhì)粒。通過感染試驗初步證實了其“菌感”能力，為下一步構(gòu)建thyA缺陷型跨界乳鏈菌腫瘤

6、特異性標記系統(tǒng)奠定基礎。
　　研究內(nèi)容：
　　本研究的內(nèi)容主要分為兩部分：
　　一.腫瘤特異性標記系統(tǒng)的構(gòu)建及其鑒定
　　方法：
　　我們采用體外基因拼裝（gene assembly）的方法得到PEG-3啟動子，經(jīng)酶切鑒定得到陽性克隆并經(jīng)測序驗證。然后利用基因克隆技術(shù)，將PEG-3啟動子、egfp、poly A亞克隆到乳鏈菌-大腸桿菌穿梭載體pTRKH2的多克隆位點中，成功得到腫瘤特異標記質(zhì)粒pTR-peg

7、3-egfp。最后，我們用pTR-peg3-egfp分別轉(zhuǎn)染腫瘤及非腫瘤細胞初步驗證其腫瘤特異性標記能力。
　　結(jié)果：
　　通過PCR基因拼裝得到460bp左右腫瘤特異性啟動子DNA序列，其測序結(jié)果與設計序列完全一致。獲得了腫瘤特異標記的乳鏈菌穿梭質(zhì)粒pTR-peg3-egfp，并在細胞水平得到初步驗證。
　　結(jié)論：
　　PEG-3啟動子介導的乳鏈菌穿梭質(zhì)粒具有腫瘤特異性，為進一步研究乳鏈菌疫苗應用于腫瘤標記及靶

8、向治療奠定基礎。
　　二.跨界乳鏈菌同源重組載體的構(gòu)建及初步驗證
　　方法：
　　通過in-fusion技術(shù)，將inv克隆至溫度依賴型乳鏈菌質(zhì)粒pVE6007中，得到pVE-inv質(zhì)粒，并送測序。將thyA-up、hly、thyA-down序列按所設計的酶切位點依次克隆入質(zhì)粒pVE-inv中，構(gòu)建同源重組質(zhì)粒pVE-inv-hly。長出的單菌落先行PCR篩選出陽性克隆，再經(jīng)酶切鑒定。分別用帶pVE-inv-hly質(zhì)粒的

9、乳鏈菌和帶pVE6007質(zhì)粒（不含inv、hly）的乳鏈菌對肝癌細胞HepG2、肺癌細胞A549進行感染試驗初步驗證其菌感能力。
　　結(jié)果：
　　測序表明，經(jīng)過in-fusion克隆的inv序列與目的序列一致。酶切鑒定結(jié)果顯示，成功構(gòu)建出約9600kb含thyA基因的上、下游同源序列、inv基因及hly基因的同源重組質(zhì)粒pVE-inv-hly。帶pVE-inv-hly質(zhì)粒的乳鏈菌進行感染試驗有菌落生長，而帶pVE6007質(zhì)粒