間充質(zhì)干細(xì)胞通過隧道納米管轉(zhuǎn)運線粒體減輕內(nèi)皮細(xì)胞缺血損傷并改善大鼠缺血性卒中預(yù)后的研究.pdf

1、前言
　　缺血性腦血管疾病已成為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，并造成了嚴(yán)重的社會經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。盡管缺血性腦血管疾病的治療研究取得了一定進展，但是現(xiàn)有的治療手段仍十分有限，治療效果并不理想。近年來，干細(xì)胞移植在缺血性腦血管疾病治療中的應(yīng)用研究，為解決這一難題提供了新的思路和方法。作為一種被廣泛研究的多能干細(xì)胞，骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)可以自身取材，既不產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，也不存在倫理問題，

2、是目前較為理想的種子細(xì)胞。
　　在缺血性腦血管疾病中，血管內(nèi)皮的損傷是主要的起病始動因素;而血管的修復(fù)，尤其是缺血半暗區(qū)受損血管的修復(fù)，又是挽救缺血受損神經(jīng)元的前提;同時腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是也導(dǎo)致血腦屏障開放、腦水腫發(fā)生，從而加重神經(jīng)元細(xì)胞損傷的重要因素。因此，保護和修復(fù)腦血管的內(nèi)皮細(xì)胞才是防治缺血性腦血管疾病的關(guān)鍵。然而，目前在干細(xì)胞治療腦梗死的研究中，多數(shù)研究聚焦于受損神經(jīng)組織的修復(fù)，但在干細(xì)胞對缺血部位受損的腦血管內(nèi)皮細(xì)

3、胞影響的研究卻亟待進一步深入。近期的研究提示，移植的間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進缺血局部區(qū)域的血管新生并減輕缺血組織的損傷;然而，其具體機制仍存在爭議:部分學(xué)者認(rèn)為干細(xì)胞通過轉(zhuǎn)分化為缺血損傷的血管組織細(xì)胞促進了血管再生，另有學(xué)者認(rèn)為移植的干細(xì)胞可以通過細(xì)胞融合發(fā)揮其保護作用，更有學(xué)者認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞通過其旁分泌的細(xì)胞因子促進了血管新生。因此，針對移植的間充質(zhì)干細(xì)胞與缺血再灌注損傷的微血管及內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用需要進一步的研究。
　　在缺

4、血再灌注損傷的復(fù)雜機制中，線粒體損傷是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。線粒體在有氧代謝、氧化磷酸化和細(xì)胞凋亡等多種病理生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。有研究顯示線粒體損傷的嚴(yán)重程度在一定程度上決定了內(nèi)皮細(xì)胞的功能和命運，并影響到后續(xù)的血管新生及缺血組織的修復(fù)。然而，當(dāng)前關(guān)于干細(xì)胞對損傷的內(nèi)皮細(xì)胞線粒體功能影響的實驗研究尚未見報道。
　　目前，一種新型通訊連接方式的發(fā)現(xiàn)正在引發(fā)人們對細(xì)胞通訊認(rèn)識的革命:最近在動物細(xì)胞間發(fā)現(xiàn)了一種細(xì)長膜管狀細(xì)胞連接-隧道納

5、米管(tunnelingnanotubes，TNTs)。作為細(xì)胞間相互交流的通道，TNTs可以在相連接的細(xì)胞間形成復(fù)雜的通訊網(wǎng)絡(luò)，并能夠運輸多種細(xì)胞組分以促進細(xì)胞間的相互交流，其中不僅包括細(xì)胞膜的成分、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的小分子，甚至線粒體等一些較大的細(xì)胞器也能通過TNTs進行轉(zhuǎn)運。越來越多的研究提示TNTs是動物細(xì)胞間一種普遍存在的相互作用方式。由此我們提出以下假設(shè):干細(xì)胞可以建立起與內(nèi)皮細(xì)胞的直接連接方式——TNTs，并通過TNTs將自身的線

6、粒體直接轉(zhuǎn)運至內(nèi)皮細(xì)胞中，修復(fù)受損內(nèi)皮細(xì)胞的能量代謝，減少細(xì)胞凋亡，以保護內(nèi)皮細(xì)胞、修復(fù)缺血受損的腦微血管系統(tǒng)，從而發(fā)揮其減輕缺血性卒中損傷并改善卒中預(yù)后的作用。
　　TNTs的發(fā)現(xiàn)揭示了一種全新的細(xì)胞間交流通道，引發(fā)了人們對細(xì)胞相互作用方式的重新思考，直到目前其研究仍處于初步階段，許多問題還有待于進一步解決。我們在前期實驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合干細(xì)胞和TNTs的最新研究進展，提出了干細(xì)胞通過TNTs直接轉(zhuǎn)移線粒體以保護缺血受損內(nèi)皮細(xì)胞的

7、推測，以圖揭示出干細(xì)胞修復(fù)缺血受損腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的機制，為干細(xì)胞在缺血性卒中治療的臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)實驗依據(jù)，同時也為干細(xì)胞治療其他缺血性疾病的機制研究提供了借鑒。
　　第一部分間充質(zhì)干細(xì)胞通過隧道納米管轉(zhuǎn)運線粒體保護類缺血損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的研究
　　研究目的
　　1、探討間充質(zhì)干細(xì)胞與共培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞間能否建立TNTs結(jié)構(gòu)聯(lián)系。
　　2、探究影響TNTs形成的因素并揭示TNTs的形成機制。
　　3、探

8、討線粒體能否通過TNTs在兩種細(xì)胞間進行有效的轉(zhuǎn)運。
　　4、探討干細(xì)胞能否通過建立TNTs轉(zhuǎn)運線粒體以保護類缺血損傷的內(nèi)皮細(xì)胞。
　　研究方法
　　1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定與標(biāo)記。密度梯度離心法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)擴增后，流式細(xì)胞術(shù)鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞表型為CD29、CD44和CD105陽性，CD34和CD45陰性。臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞獲贈于山東大學(xué)心血管蛋白質(zhì)組重點實驗室。采用慢病毒介導(dǎo)

9、的增強型綠色熒光蛋白標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞分選術(shù)將其純化。另外，應(yīng)用pAcGFP1-Mitovector和pDsRed2-Mitovector分別對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的線粒體進行標(biāo)記。
　　2、對比分析正常條件下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體功能。通過生物能量代謝監(jiān)測儀分析細(xì)胞的耗氧率(oxygenconsumptionrate，OCR)和產(chǎn)酸率(extracellularacidificatio

10、nrate，ECAR)，經(jīng)細(xì)胞計數(shù)校正后的耗氧率和產(chǎn)酸率數(shù)值可直接反映出MSCs和HUVECs的線粒體功能差異。
　　3、建立干細(xì)胞與類缺血損傷后內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)模型。
　　在缺氧培養(yǎng)箱中對HUVECs實施氧糖剝奪處理150分鐘，再將處理的細(xì)胞進行復(fù)氧復(fù)糖處理，4小時后將等量的間充質(zhì)干細(xì)胞與之直接混合培養(yǎng)，以建立干細(xì)胞與類缺血損傷后內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)模型。
　　4、激光共聚焦顯微鏡觀察隧道納米管的形成及線粒體在其中的轉(zhuǎn)運

11、。
　　應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察共培養(yǎng)的MSCs和HUVECs之間隧道納米管的形成以及線粒體在其中的轉(zhuǎn)運情況，并對不同干預(yù)條件下的兩種細(xì)胞間形成的TNT及膜突起(membraneprotrusions，MPs)計數(shù)統(tǒng)計。
　　5、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分選并定量分析混合培養(yǎng)后兩種細(xì)胞間線粒體的相互轉(zhuǎn)移率。
　　利用Hoechst33342標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞核，以及干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞兩種細(xì)胞間的形態(tài)差異，采用流式細(xì)胞分選術(shù)將共

12、培養(yǎng)48小時后的兩種細(xì)胞分選開來。再應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)定量分析線粒體在兩種細(xì)胞間的相互轉(zhuǎn)移率。
　　6、分析間充質(zhì)干細(xì)胞對共培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的有氧代謝、細(xì)胞活性及凋亡率的影響;并檢測絲狀肌動蛋白（filamentousactin，F(xiàn)-actin）解聚劑latrunculin-A(LatA)、磷脂酰絲氨酸位點阻斷劑AnnexinV和線粒體功能缺失的干細(xì)胞對其共培養(yǎng)效應(yīng)的影響。
　　采用流式細(xì)胞分選術(shù)將不同的共培養(yǎng)組中的臍靜脈內(nèi)皮

13、細(xì)胞分離出來。采用FITCAnnexinV凋亡試劑盒分析內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率，采用CellCountingKit-8(CCK-8)分析內(nèi)皮細(xì)胞活性，使用生物能量代謝監(jiān)測儀分析內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體功能。
　　7、分析干細(xì)胞的旁分泌功能和細(xì)胞融合等因素對內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響。
　　收集濃縮不同處理條件下的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液，應(yīng)用ELISA試劑盒檢查其中的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascularendothelialgrowthfactor

14、,VEGF)、血小板源性生長因子(platelet-derivedgrowthfactorBB，PDGF-BB)和成纖維細(xì)胞生長因子-2(fibroblastgrowthfactor2，F(xiàn)GF-2)的含量，以明確干細(xì)胞的旁分泌功能對內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響。
　　采用直接測序法對比檢測共培養(yǎng)前后的HUVECs和MSCs的線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)，明確共培養(yǎng)后被MSCs營救的HUVECs是否含有來源于M

15、SCs的線粒體。應(yīng)用短串聯(lián)重復(fù)序列方法對比分析共培養(yǎng)前后的HUVECs和MSCs的核DNA(nuclearDNA，nDNA)，明確共培養(yǎng)后被MSCs營救的HUVECs是否含有來源于MSCs的細(xì)胞核，也即是分析細(xì)胞融合的可能性。
　　將染色標(biāo)記好的血小板和干細(xì)胞線粒體加入缺血受損的內(nèi)皮細(xì)胞中直接共培養(yǎng)，激光共聚焦顯微鏡觀察共培養(yǎng)48小時后的內(nèi)皮細(xì)胞的生存狀況，從而分析內(nèi)皮細(xì)胞是否主動吞噬了細(xì)胞外游離的線粒體。
　　研究結(jié)果

16、r>　　1、生物能量代謝監(jiān)測儀分析證實間充質(zhì)干細(xì)胞具有顯著優(yōu)于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體功能(p＜0.05)。
　　2、激光共聚焦顯微鏡證實共培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞間可建立隧道納米管結(jié)構(gòu)聯(lián)系，線粒體可在其中進行雙向轉(zhuǎn)運（兩種細(xì)胞間的雙向轉(zhuǎn)移率大致均衡）。
　　3、激光共聚焦顯微鏡證實類缺血再灌注損傷能介導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞間建立更為復(fù)雜和廣泛的網(wǎng)絡(luò)狀TNT聯(lián)系，并促使TNT中的線粒體雙向交換變?yōu)閱蜗蜣D(zhuǎn)運（由

17、干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞方向），且（流式細(xì)胞術(shù)證實）其轉(zhuǎn)移率顯著提高。
　　4、LatA和AnnexinV可顯著減少臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞間的TNTs數(shù)量，表明TNTs的形成是依賴F-actin的聚合和磷脂酰絲氨酸的外化的過程。
　　5、間充質(zhì)干細(xì)胞通過隧道納米管將自身線粒體轉(zhuǎn)運至類缺血再灌注損傷的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，以修復(fù)其有氧代謝功能并減少細(xì)胞凋亡。F-actin解聚劑LatA、磷脂酰絲氨酸位點阻斷劑AnnexinV均可顯著

18、抑制該保護效應(yīng)(p＜0.05)。另外，盡管線粒體功能缺失的MSCs完全喪失了對內(nèi)皮細(xì)胞有氧代謝功能的修復(fù)，但仍可以部分減輕內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡(p＜0.05)，這提示TNTs還可能通過轉(zhuǎn)運其他物質(zhì)的方式發(fā)揮其對內(nèi)皮細(xì)胞的保護效應(yīng)。
　　6、LatA和AnnexinV的處理對間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌促血管新生作用細(xì)胞因子(VEGF,PDGF-BB，F(xiàn)GF-2)的功能沒有顯著影響，因此間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌功能不是其保護內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)鍵機制。另一方

19、面，被拯救的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的nDNA來源母系的內(nèi)皮細(xì)胞，而其mtDNA則同時含有MSCs和母系內(nèi)皮細(xì)胞兩種組分，這一結(jié)果不僅支持線粒體在異種細(xì)胞間發(fā)生了轉(zhuǎn)移，同時也排除了發(fā)生細(xì)胞融合的可能性。此外，將染色標(biāo)記好的血小板和干細(xì)胞線粒體加入缺血損傷的內(nèi)皮細(xì)胞中直接共培養(yǎng)48小時，內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體功能、細(xì)胞活性和凋亡率均沒有明顯改善，且細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)含有被染色標(biāo)記的線粒體，表明缺失損傷后的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞不具有主動吞噬線粒體的功能。
　　第

20、二部分間充質(zhì)干細(xì)胞保護大鼠腦微血管系統(tǒng)線粒體的功能并改善缺血性卒中預(yù)后的研究
　　研究目的
　　1、研究間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大腦中動脈閉塞后再灌注大鼠的腦梗死面積的影響。
　　2、探討間充質(zhì)干細(xì)胞移植對腦梗死大鼠運動神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。
　　3、研究間充質(zhì)干細(xì)胞對腦梗死大鼠缺血腦組織血管新生的影響。
　　4、探討間充質(zhì)干細(xì)胞移植對缺血受損腦微血管的線粒體功能的影響。
　　5、進一步探討隧道納米管介導(dǎo)的線

21、粒體轉(zhuǎn)移機制在干細(xì)胞改善腦梗死大鼠預(yù)后中的作用。
　　研究方法
　　1、建立大鼠的大腦中動脈閉塞后再灌注模型。
　　線栓法制備大鼠的大腦中動脈閉塞(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)后再灌注模型。在MACO120分鐘后撤出尼龍線恢復(fù)大腦中動脈的灌注，術(shù)中采用多普勒儀證實閉塞和再灌注的效果。術(shù)后對大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分，并根據(jù)評分結(jié)果選取大鼠進人下一步實驗
　　2、建立經(jīng)動脈途

22、徑將間充質(zhì)干細(xì)胞植入缺血損傷的大鼠腦微血管系統(tǒng)的模型。
　　對大鼠的間充質(zhì)干細(xì)胞進行分離、培養(yǎng)和鑒定。為示蹤移植的干細(xì)胞及其線粒體，用Hoechst33342標(biāo)記MSCs的細(xì)胞核，應(yīng)用pDsRed2-Mitovector對干細(xì)胞的線粒體進行標(biāo)記。在大腦中動脈閉塞再灌注術(shù)后24小時，使用顯微注射針將5×105MSCs緩慢注入右側(cè)頸內(nèi)動脈系統(tǒng)并密切觀察術(shù)中術(shù)后的大鼠病情變化。
　　3、2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色法分析大鼠腦

23、梗死體積。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞移植術(shù)7天后，采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC)對不同處理組大鼠梗死后的腦組織進行染色，應(yīng)用ImageJ軟件進一步分析梗死體積。
　　4、測試腦梗死大鼠的運動神經(jīng)功能。
　　應(yīng)用轉(zhuǎn)棒疲勞實驗和跑輪實驗對MCAO術(shù)前及MSCs移植術(shù)后的第1、7、14和28天的大鼠進行測試，以評估間充質(zhì)干細(xì)胞移植及其它不同處理因素對腦

24、梗死大鼠的運動神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。
　　5、探討腦微血管的密度與接受移植干細(xì)胞線粒體的宿主細(xì)胞數(shù)量間的關(guān)系。
　　受試大鼠接受動脈注射的綠色熒光染料(fluoresceinisothiocyanate-dextranamine，F(xiàn)D-2000S)以達(dá)到激光共聚焦顯微鏡下腦微血管充分顯影的效果。將腦組織固定并制作冰凍切片。共聚焦顯微鏡下觀察梗死核心區(qū)和缺血半暗區(qū)的腦微血管的密度與接受干細(xì)胞線粒體的宿主細(xì)胞（DsRed2+/Ho

25、echst33342-cells）數(shù)量間的關(guān)系。
　　6、分離純化腦微血管片段，并檢測其線粒體功能。
　　取梗死側(cè)的大腦半球，采用兩次酶消化法和密度梯度離心法分離和純化腦微血管片段。將純化的腦微血管片段置于Ⅳ型膠原和纖連蛋白覆蓋的XF24組織培養(yǎng)皿內(nèi)，使用生物能量代謝監(jiān)測儀分析微血管片段的線粒體功能。
　　研究結(jié)果
　　1、間充質(zhì)干細(xì)胞移植顯著減少大腦中動脈閉塞大鼠的腦梗死面積(p＜0.05)。
　　2、間

26、充質(zhì)干細(xì)胞移植可促進腦梗死大鼠運動功能的恢復(fù)(p＜0.05)。
　　3、間充質(zhì)干細(xì)胞移植顯著增加缺血半暗區(qū)的腦微血管密度(p＜0.05)。
　　4、間充質(zhì)干細(xì)胞可有效改善缺血損傷腦微血管片段的線粒體功能(p＜0.05)。
　　5、LatA和AnnexinV并不影響缺血半暗區(qū)內(nèi)DsRed2+/Hoechst33342+細(xì)胞的數(shù)量（DsRed2+/Hoechst33342+細(xì)胞即為示蹤出的植入術(shù)后全部的MSCs，包括了可能

27、發(fā)生細(xì)胞融合和轉(zhuǎn)分化的MSCs），證實LatA和AnnexinV對干細(xì)胞的歸巢、滯留和遷移沒有造成顯著影響。然而，TNTs的抑制劑LatA和AnnexinV可顯著減少缺血半暗區(qū)內(nèi)DsRed2+/Hoechst33342-細(xì)胞的數(shù)量（DsRed2+/Hoechst33342-細(xì)胞為接受干細(xì)胞轉(zhuǎn)移線粒體的宿主細(xì)胞），同時也顯著抑制了干細(xì)胞的對腦梗死大鼠的保護效應(yīng)(p＜0.05)，提示其保護效可能與隧道納米管介導(dǎo)的線粒體轉(zhuǎn)移密切相關(guān);同時也進

28、一步證實了旁分泌功能、細(xì)胞融合和轉(zhuǎn)分化等因素不是干細(xì)胞保護效應(yīng)的關(guān)鍵機制。
　　綜上所述
　　1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有顯著優(yōu)于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體功能。間充質(zhì)干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間可建立隧道納米管結(jié)構(gòu)聯(lián)系，兩種細(xì)胞的線粒體可在其中進行雙向轉(zhuǎn)運。正常條件下兩種細(xì)胞之間線粒體的轉(zhuǎn)運頻率大致均等。
　　2、類缺血再灌注損傷能介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞間建立更為廣泛和復(fù)雜的TNTs聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)，并促使TNTs介導(dǎo)的線粒體雙向均等交換

29、轉(zhuǎn)變?yōu)閺母杉?xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞方向的單向轉(zhuǎn)運，其轉(zhuǎn)移率也顯著提高。從而使間充質(zhì)干細(xì)胞能有效修復(fù)受損內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體功能并減少細(xì)胞凋亡。
　　3、TNTs的形成可能反映了細(xì)胞在應(yīng)激或損傷狀態(tài)下表現(xiàn)出的一種自我防御和營救機制。TNTs的形成依賴于絲狀肌動蛋白的聚合以及磷脂酰絲氨酸位點的外化與識別。
　　4、體內(nèi)實驗進一步證實:間充質(zhì)干細(xì)胞通過隧道納米管轉(zhuǎn)運線粒體可能是其保護缺血受損腦微血管的線粒體功能、促進血管新生并改善卒中大鼠的預(yù)后