塔斯品堿及其衍生物對乳腺癌生長的抑制作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、乳腺癌是一種是危害女性健康最常見的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率、死亡率高等特點(diǎn)。目前，藥物干預(yù)是乳腺癌的主要治療方法，近年來抗乳腺癌藥物開發(fā)取得了較大的進(jìn)展，然而由于乳腺癌發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性和演變的不可預(yù)知性，還尚未尋找出有效的預(yù)防和治愈乳腺癌的方法。因此，不斷研究開發(fā)新型的抗乳腺癌藥物顯得尤為重要。由于天然植物中所含成分多樣，化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎，從天然植物中尋找活性成分，大規(guī)模快速篩選具有抗腫瘤活性的先導(dǎo)化合物，通過化學(xué)結(jié)構(gòu)的修飾與改造，得到低毒

2、、高效的新型藥物是當(dāng)今抗腫瘤藥物研究與開發(fā)的熱點(diǎn)。
　　塔斯品堿是本實(shí)驗室采用細(xì)胞膜色譜模型首次從陜西秦巴山區(qū)特有藥用植物紅毛七中篩選得到的化合物，具有多種藥理活性，能夠抑菌、抗炎、促進(jìn)傷口愈合，抑制S180肉瘤生長。本研究通過體外和體內(nèi)實(shí)驗考察了塔斯品堿及其結(jié)構(gòu)修飾后的衍生物HMQ1611對乳腺癌生長的影響，并對其作用機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)研究，旨在為開發(fā)新型的抗乳腺癌藥物提供依據(jù)。本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果包括以下幾個方面：
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3、.塔斯品堿對乳腺癌的抑制作用
　　體外培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30，采用MTT法考察了塔斯品堿對乳腺癌細(xì)胞活力的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測塔斯品堿對細(xì)胞周期和凋亡的影響，western blotting和RT-PCR測定塔斯品堿對ERα及其相關(guān)受體PR mRNA和蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明，塔斯品堿能夠抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期于 S期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，下調(diào) ERα和PR表達(dá)。建立了ZR-75-30裸鼠移植瘤模型，對塔斯品堿的體內(nèi)抗

4、乳腺癌作用進(jìn)行了驗證，塔斯品堿連續(xù)給藥后顯著抑制了腫瘤的生長。
　　建立了利用 HPLC-MS檢測塔斯品堿作用后兩種 EGFR高表達(dá)細(xì)胞，A431和HEK293/EGFR細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外塔斯品堿的含量的方法，并結(jié)合建立的兩種細(xì)胞的細(xì)胞膜色譜模型研究了塔斯品堿和EGFR的相互作用，然后采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和實(shí)時熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）考察了塔斯品堿對EGFR mRNA和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，

5、隨著塔斯品堿作用濃度的增加，進(jìn)入細(xì)胞的藥物濃度相應(yīng)增加，塔斯品堿可以作用于細(xì)胞膜上的EGFR，抑制細(xì)胞 EGFR的表達(dá)。以上結(jié)果說明塔斯品堿通過下調(diào)ERα和EGFR的表達(dá)，抑制乳腺癌的生長。
　　2.塔斯品堿衍生物HMQ1611對乳腺癌的抑制作用
　　采用 MTT法考察 HMQ1611對四種乳腺癌細(xì)胞活力的影響，流式細(xì)胞儀檢測HMQ1611對細(xì)胞周期和凋亡的影響，并運(yùn)用 siRNA干擾和質(zhì)粒 DNA瞬時轉(zhuǎn)染驗證HMQ1611

6、是否以ERα為作用靶點(diǎn)。結(jié)果表明，HMQ1611能夠抑制四種乳腺癌細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞周期于S期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HMQ1611對ERα陽性乳腺癌細(xì)胞的抑制作用優(yōu)于對ERα陰性乳腺癌細(xì)胞，采用siRNA干擾的方法沉默ZR-75-30細(xì)胞中ERα表達(dá)后，與對照組相比，抑制作用降低，而向 MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 ERα后，與對照組相比，抑制作用增強(qiáng)，說明ERα是HMQ1611的作用靶點(diǎn)。
　　采用western blotting

7、和real-time PCR檢測HMQ1611對ERα和EGFR信號通路的影響，結(jié)果顯示，HMQ1611能夠下調(diào)ERα的mRNA和蛋白表達(dá)，抑制E2激活的MAPK通路，降低 EGFR磷酸化水平及其下游信號級聯(lián)反應(yīng) MAPK和PI3K/Akt，說明HMQ1611通過下調(diào)ERα mRNA和蛋白表達(dá)，阻斷E2的基因組通路和膜ERα所介導(dǎo)的E2激活的MAPK通路，同時抑制EGFR的活性，繼而阻斷其下游的信號級聯(lián)MAPK和PI3K/Akt通路。<

8、br>　　建立了ZR-75-30裸鼠移植瘤模型驗證HMQ1611的體內(nèi)抑瘤活性，發(fā)現(xiàn)HMQ1611能夠顯著抑制裸鼠移植瘤的體積和瘤重，并且在整個實(shí)驗過程中，與對照組相比HMQ1611給藥組小鼠的體重與對照組相比沒有降低，同時也無其他異?，F(xiàn)象發(fā)生。
　　3.塔斯品堿衍生物HMQ1611對乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用
　　采用Millicell小室模型和劃痕實(shí)驗?zāi)Ｐ涂疾炝薍MQ1611對乳腺癌細(xì)胞粘附、遷移和侵襲的影響，采用明膠酶譜

9、法和western blotting實(shí)驗檢測了細(xì)胞中MMP-2和MMP-9活性和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明，HMQ1611可以抑制乳腺癌細(xì)胞粘附、遷移和侵襲能力，其作用機(jī)制是通過抑制MMP-2和MMP-9活性和蛋白表達(dá)，抑制了乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
　　綜上所述，塔斯品堿能夠顯著抑制乳腺癌的生長，可以作為新型的抗乳腺癌先導(dǎo)化合物。對塔斯品堿結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到的塔斯品堿衍生物 HMQ1611能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲，同時通過作用于ERα和EGF