攜綠色熒光蛋白的人低氧誘導(dǎo)因子1α及其突變型重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、背景 缺血性心臟病目前常規(guī)治療包括藥物治療、冠脈介入(PCI)及冠脈旁路移植術(shù)(CABG)，然而相當(dāng)一部分患者藥物治療難以見(jiàn)效，也不適于常規(guī)血管再通術(shù)處理，另外還有些患者經(jīng)過(guò)上述處理后仍然存在冠脈再狹窄、心肌微、小血管功能障礙、心功能低下，因此必須尋求其它方法。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的巨大進(jìn)步，基因治療促缺血心肌血管新生已成為冠脈血運(yùn)重建術(shù)中具有發(fā)展前景的新方向，目前血管新生是生物學(xué)界基因治療發(fā)展最快的領(lǐng)域。促血管生長(zhǎng)因子研究較

2、多的有VEGF、FGF等，雖然Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果證明安全有效，但Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果并不理想，資料顯示VEGF可導(dǎo)致新生血管組織水腫、血管通透性增高、易發(fā)生炎癥反應(yīng)等，甚至可能促進(jìn)動(dòng)脈硬化進(jìn)展，毛細(xì)血管過(guò)度增殖及血管瘤形成等，F(xiàn)GF治療則與蛋白尿有關(guān)。血管生長(zhǎng)過(guò)程本身受一系列生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)，是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，單個(gè)生長(zhǎng)因子治療并不足以誘導(dǎo)成熟的血管新生。低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxiainduciblefactor1，HIF-1)是細(xì)胞對(duì)缺氧作出

3、適應(yīng)性反應(yīng)的上游關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)對(duì)VEGF、Ang、EPO、PDGF、HO-1等60多種靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控參與了血管新生、紅細(xì)胞生成等病理生理過(guò)程。臨床前期研究表明，應(yīng)用具有組成型表達(dá)活性的HIF-1α基因治療可誘導(dǎo)生理功能完整的血管新生。HIF-1α誘導(dǎo)的新生血管具有無(wú)明顯炎癥反應(yīng)、不滲漏、不引起組織水腫的特點(diǎn)，此外，HIF-1α還可以促進(jìn)EPO、HO-1、INOS等基因的轉(zhuǎn)錄，具有抗細(xì)胞凋亡、改善心肌細(xì)胞代謝等血管新生以外的作用。

4、因此，人們對(duì)HIF-1α的促血管新生治療給予厚望。HIF-1具有α、β兩個(gè)亞單位，HIF-1α受氧濃度的調(diào)節(jié)，決定HIF-1的活性。但HIF-1α常氧下容易降解，主要與常氧狀態(tài)下HIF-1αODDD區(qū)Pro564和Pro402發(fā)生羥基化導(dǎo)致其水解有關(guān)，突變其中任一位點(diǎn)的單突變型HIF-1α在常氧下都可以得到表達(dá)；而Pro804突變可以促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄。綠色熒光蛋白(EGFP)是基因工程中常用的標(biāo)記物，不影響目標(biāo)基因的效應(yīng)，其突出的有點(diǎn)在

5、于EGFP與蛋白偶聯(lián)后可在活體細(xì)胞或生物體內(nèi)動(dòng)態(tài)觀察目標(biāo)蛋白的表達(dá)、分布及其效應(yīng)。腺病毒載體較其他病毒載體具有制備容易、感染譜廣、病毒滴度高、表達(dá)時(shí)間短(1-2周)，不引起插入突變等優(yōu)點(diǎn)而成為治療性血管新生最具臨床應(yīng)用價(jià)值的載體之一。我們?cè)趯ro564定點(diǎn)突變?yōu)锳la564、Pro803定點(diǎn)突變?yōu)锳la803及表達(dá)分析的基礎(chǔ)上，在解決了HIF-1α在常氧下蛋白穩(wěn)定和促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)上，為更直觀的研究HIF-1α基因及其突變型在細(xì)胞和動(dòng)物

6、中的分布、表達(dá)和效應(yīng)，擬構(gòu)建攜EGFP的含HIF-1α、HIF-1α-Ala564及HIF-1α-Ala564-Ala802基因的重組腺病毒載體Adeno-EGFP-HIF-1α、Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564、Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala802，為研究HIF-1α基因及其突變型對(duì)缺血性心臟病的血管新生作用及以后的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 目的 構(gòu)建能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞得到外源基因高表

7、達(dá)的攜帶EGFP和HIF-1α及其突變型HIF-1α-Ala564、HIF-1α-Ala564-Ala803基因的重組腺病毒載體Adeno-EGFP-HIF-1α、Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564及Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803，為更直觀的研究HIF-1α基因及其突變型對(duì)缺血性心臟病的血管新生作用及以后的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法 采用體外連接的重組腺病毒方法，由表達(dá)質(zhì)粒pc

8、DNA3.1(+)-HIF-1α、pcDNA3.1(+)-HIF-1α-Ala564及pcDNA3.1(+)-HIF-1α-Ala564-Ala803通過(guò)KpnI、ApaI雙酶切獲得包括起始密碼子在內(nèi)的HIF-1α、HIF-1α-Ala564、HIF-1α-Ala564-Ala803的eDNA片段，克隆到質(zhì)粒pEGFP-C1，得到pEGFP-HIF-1α-c1、pEGFP-HIF-1α-Ala564-c1及pEGFP-HIF-1α-Al

9、a564-Ala804-c1。行酶切和PCR鑒定成功后以Nhel、Apal雙酶切得到EGFP-HIF1α、EGFP-HIF-1α-Ala564、EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803cDNA，重組到穿梭質(zhì)粒pShuttle2，得到重組穿梭質(zhì)粒pShuttle2-EGFP-HIF-1α、pShuttle2-EGFP-HIF-1α-Ala564及pShuttle2-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala804，行酶切和PC

10、R鑒定。穿梭質(zhì)粒pShuttle2的人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(hCMV)和SV40多聚腺苷酸尾(polyA)之間的多克隆位點(diǎn)間，以PI-SceI和I-CeuI雙酶切重組穿梭質(zhì)粒，獲得含有CMV-EGFP-HIF1α、CMV-EGFP-HIF-1α-Ala564、CMV-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803cDNA的表達(dá)盒，與線性化的腺病毒骨架質(zhì)粒Adeno-XViralDNA連接，經(jīng)SwaI酶切去除Adeno-XViralDNA

11、自身環(huán)化質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，重組成pAdeno-EGFP-HIF1α、pAdeno-EGFP-HIF-1α-Ala564及pAdeno-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803腺病毒質(zhì)粒，鑒定成功后再分別經(jīng)PacI酶切線性化并暴露其兩端的反向重復(fù)序列(ITRs)，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，待出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)后收集細(xì)胞，-70℃～37℃反復(fù)凍融細(xì)胞3次得到含重組病毒的病毒液，終點(diǎn)稀釋實(shí)驗(yàn)法測(cè)定病

12、毒滴度，包裝成為重組Adeno-EGFP-HIF1α、Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564及Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803腺病毒。取部分病毒液加入HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增病毒，并進(jìn)行PCR、測(cè)序鑒定及滴度測(cè)定。 結(jié)果 經(jīng)酶切、PCR鑒定及基因測(cè)序證實(shí)重組質(zhì)粒pEGFP-HIF-1α-c1、pEGFP-HIF-1α-Ala564-c1、pEGFP-HIF-1α-Ala564-Ala

13、804-c1構(gòu)建成功，重組穿梭質(zhì)粒pShuttle2-EGFP-HIF-1α、pShuttle2-EGFP-HIF-1α-Ala564及pShuttle2-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala804及重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-EGFP-HIF1α、pAdeno-EGFP-HIF-1α-Ala564及pAdeno-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803構(gòu)建成功。重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞綠色熒光顯微鏡下觀察顯

14、示轉(zhuǎn)染效率約20％-30％，10-14天即可出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)。經(jīng)測(cè)序證實(shí)重組腺病毒Adeno-EGFP-HIF1α中的HIF1αcDNA564位為脯氨酸(Pro)密碼子CCC；重組腺病毒Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564的HIF-1αcDNA564位為脯氨酸密碼子CCC突變?yōu)楸彼?Ala)密碼子GCC，803位為天冬酰胺(Asn)密碼子AAT；重組腺病毒Adeno-HIF-1α-Ala564-Ala803的HIF-1αc

15、DNA564位脯氨酸密碼子CCC突變?yōu)楸彼?Ala)密碼子GCC，803位天冬酰胺(Asn)密碼子AAT突變?yōu)楸彼?Ala)密碼子GCT。包裝后反復(fù)凍融細(xì)胞3次得到含重組病毒的病毒液，加入到HEK293可見(jiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，擴(kuò)增病毒后提病毒DNA行PCR檢測(cè)重組腺病毒均得到預(yù)期的460、214、287bp目的片斷，終點(diǎn)稀釋實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)重組腺病毒Adeno-EGFP-HIF1α、Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564及A

16、deno-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803的滴度分別為1.3×108pfu/ml、2.0×108pfu/ml和1.8×108pfu/ml。 結(jié)論 成功構(gòu)建重組腺病毒Adeno-EGFP-HIF-1α、Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564及Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803(對(duì)照載體Adeno-EGFP已由童鍇同學(xué)構(gòu)建)，為缺血性心臟病的HIF-1α基因治療研究奠定