日本血吸蟲期特異性新基因Sj314C10的克隆、表達(dá)和功能分析.pdf

1、　　利用RACE技術(shù)釣取日本血吸蟲成蟲期特異表達(dá)基因ESTs的全長(zhǎng)cDNA，以期尋找到新的編碼日本血吸蟲病的診斷抗原或候選分子疫苗。通過(guò)分析一系列日本血吸蟲成蟲期特異表達(dá)基因的ESTs，篩選其中一條EST設(shè)計(jì)巢式PCR引物，進(jìn)行第一次RACE。純化目的條帶，連接克隆載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序；將測(cè)序結(jié)果連接到源序列的EST上；之后進(jìn)行“電子克隆”得到一新的EST。再以該EST片段設(shè)計(jì)巢式PCR引物，用相同方法進(jìn)行第二次RACE，

2、直到序列不再延伸為止。對(duì)兩次RACE后連接得到的DNA序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，進(jìn)行GenBank的注冊(cè)。然后，選取其完整開放閱讀框(ORF)設(shè)計(jì)合成雙酶切位點(diǎn)的引物，進(jìn)行PCR體外擴(kuò)增，純化目標(biāo)條帶。連接到相同酶切的原核表達(dá)載體pET28a(+)上，轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliBL21。用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，觀察各種條件下對(duì)重組菌蛋白表達(dá)的影響。回收蛋白，完成表達(dá)產(chǎn)物的純化和生物活性研究，并進(jìn)行蛋白的功能分析。結(jié)果表明經(jīng)兩次RACE擴(kuò)增，獲得了

3、一含完整ORF的全長(zhǎng)基因片段，測(cè)序及序列分析表明該基因?yàn)槿毡狙x一新基因，GenBank注冊(cè)號(hào)為AY847290，命名為Sj314C10。對(duì)此基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能域分析表明該蛋白氨基酸序列與桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域有78﹪的同源性。IPTG誘導(dǎo)該基因的原核表達(dá)重組菌，SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)大約在50ku位置出現(xiàn)一條表達(dá)條帶，而且隨著時(shí)間的推移表達(dá)產(chǎn)物的量逐漸增大。同時(shí)，研究顯示：溫度、IPTG濃度和表達(dá)時(shí)相的改變對(duì)蛋白包涵體可