腎移植術(shù)后受者BK病毒感染和BK病毒相關(guān)性腎病的前瞻性研究.pdf

1、目的：
　　1、利用實時熒光定量PCR(Real-Time Fluorescent Quantitative，PCR)方法設(shè)計并建立BKV檢測試劑盒，便于實驗室對BKV進行簡單快捷且大規(guī)模的篩選和預(yù)測。
　　2、研究腎移植術(shù)后受者無創(chuàng)性實驗室檢測(尿沉渣分析Decoy細胞，尿、血標本檢測BKV DNA載量)用于診斷BKV感染并預(yù)測BKVAN的價值，分析確定本實驗研發(fā)的BK病毒檢測試劑盒用于診斷BKV感染及預(yù)測BKVAN進展的

2、標準值(范圍)。
　　3、通過單中心前瞻性的臨床實驗研究，分析影響B(tài)K病毒感染及并發(fā)BKVAN的危險因素。
　　4、對BKV血癥陽性和病理學診斷BKVAN的移植受者進行初步的臨床干預(yù)治療，評估療效。
　　方法：
　　1、設(shè)計并建立實時熒光定量PCR方法檢測BK病毒試劑盒：(1)根據(jù)針對BK病毒基因組自行設(shè)計特異性引物BKV-F和BKV-R以及Taqman熒光探針BKV-P。(2)BK病毒DNA聚合酶鏈式反應(yīng)液的配

3、制。(3)檢測反應(yīng)。(4)BK病毒樣本的處理與DNA提取。(5)構(gòu)建BKV定量標準品Ⅰ-Ⅳ。(6)反應(yīng)結(jié)果判斷。(7)結(jié)果驗證：將檢測陽性的擴增產(chǎn)物進行基因測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對后證實為BKV基因序列。(8)建立BK病毒檢測試劑盒。
　　2、研究腎移植術(shù)后受者無創(chuàng)性實驗室檢測方法價值：(1)根據(jù)制定的入組標準選擇2010年02月01日至2011年01月31日在解放軍第309醫(yī)院器官移植中心進行同種異體腎移植術(shù)的116例受者

4、作為研究對象，分別在移植術(shù)前病毒檢查及移植術(shù)后第0.5、1、3、6、9、12和15個月時間點定期收集受者的尿液和外周血(PB)標本，進行尿脫落細胞形態(tài)學鏡檢(巴氏染色法)Decoy細胞，并應(yīng)用本實驗研發(fā)的BKV檢測試劑盒檢測尿和血標本中BKVDNA載量，記錄檢測結(jié)果。(2)對具備指征的移植術(shù)后受者行組織活檢(在B超引導(dǎo)下)，對移植腎進行病理學診斷(普通染色及免疫組化法)。
　　3、將入選研究對象按照Decoy細胞陽性、病毒尿癥(v

5、iruria)陽性、病毒血癥(viremia)陽性和病理學確診BKVAN分為四組，分別統(tǒng)計記錄性別年齡免疫誘導(dǎo)方案供腎類型術(shù)后并發(fā)糖尿病(PTDM)急性排斥反應(yīng)和(AR)術(shù)后早期肺部感染(pneumonia)以及免疫誘導(dǎo)方案、單獨和聯(lián)合免疫抑制方案等資料，統(tǒng)計腎移植術(shù)后BKV的發(fā)病率、發(fā)病趨勢，分析BKV檢測試劑盒診斷BKV感染并預(yù)測BKVAN的價值，確定診斷標準值(范圍)，并進一步分析影響腎移植術(shù)后BKv感染及BKVAN的相關(guān)危險因素

6、。
　　4、依據(jù)國外參考文獻資料，嘗試對出現(xiàn)BKV血癥及BKV相關(guān)性腎病(BKVAN)受者進行臨床干預(yù)，觀察治療前、后BKV DNA載量及相應(yīng)的腎功能等指標的變化情況。
　　5、應(yīng)用Excel2007軟件進行實驗數(shù)據(jù)錄入及表格繪制。應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件(16.0版)統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)應(yīng)用平均值士標準差表示，并應(yīng)用隨機分組t檢驗、方差分析進行統(tǒng)計學分析，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)應(yīng)用平均值，最小值和最大值表示，并應(yīng)用秩和

7、檢驗進行統(tǒng)計學分析。應(yīng)用ROC曲線下面積對比分析BK病毒尿癥和BK病毒血癥預(yù)測BKVAN進展的價值，應(yīng)用相關(guān)分析和logistic回歸分析BK病毒感染的危險因素。應(yīng)用graphpad(5.0版)軟件進行繪圖制作。
　　結(jié)果：
　　1、研發(fā)的BKV試劑盒檢測陽性結(jié)果的范圍為1.0×103 copies/ml到1.0×1010 copies/ml。不與包括乙肝病毒(HBV)，丙肝病毒(HCV)，EB病毒(EBV)，人巨細胞病毒(

8、HCMV)，人類乳頭狀瘤病毒B19(HPV B19)和JC病毒(JCV)等其它病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。標本檢測時間一般為1.5至2小時(與樣本量有關(guān))。
　　2、經(jīng)過15個月定時監(jiān)測116例腎移植受者的結(jié)果顯示尿沉渣Decoy細胞陽性(Median7個/10HPF，[1-48個/10HPF])，BK病毒尿癥(Median2.63×105 copies/ml，[1.78×103-8.54×109 copies/ml])，BK病毒血癥(Me

9、dian2.70×104 copies/ml，[1.95×103-6.31×106 copies/ml])的發(fā)生率分別為53.46％，24.17％和20.72％，活檢穿刺病理學診斷BKVAN受者共4例，發(fā)病率為3.45％。移植術(shù)后3個月左右是Decoy細胞陽性、BK病毒尿癥及BK病毒血癥發(fā)生的高峰時段。
　　3、移植術(shù)后尿BKV DNA載量和血BKV DNA載量隨時間的變化趨勢基本一致，尿液BKV DNA載量的平均值水平(Log1

10、0)是血BKV DNA載量的平均值水平(Log10)的2.56倍。
　　4、(1)發(fā)生BKVAN受者的尿BKV DNA載量中位數(shù)為7.36×107copies/ml，未發(fā)生BKVAN但病毒血癥陽性受者的尿BKV DNA載量中位數(shù)為5.73×105 copies/ml，而未發(fā)生BKVAN且病毒血癥陰性(即僅為病毒尿癥陽性)受者的尿BKV DNA載量中位數(shù)為5.53×105 copies/ml，前兩者及三者之間比較有統(tǒng)計學差異(P=0

11、.02)，但后兩者比較未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學差異(P=0.334)。(2)發(fā)生BKVAN受者的血BKV DNA載量中位數(shù)為5.07×105copies/ml，未發(fā)生BKVAN受者的血BKV DNA載量中位數(shù)為4.33×105copies/ml，兩組比較具有統(tǒng)計學差異(P=0.04)。(3)4例確診BKVAN的受者的病毒血癥及病毒尿癥均為陽性。
　　5、應(yīng)用相關(guān)分析和logistic回歸統(tǒng)計學結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)促進116例受者移植術(shù)后BKV血癥進

12、展的一般臨床獨立危險因素為術(shù)前病毒血癥陽性(r=0.457，P=0.000)。其它包括性別年齡免疫誘導(dǎo)方案供腎類型術(shù)后并發(fā)糖尿病、急性排斥反應(yīng)和術(shù)后早期肺部感染等因素與BKV感染和BKVAN無相關(guān)性。
　　6、116例移植受者術(shù)后服用CsA和FK506的受者BKV DNA載量陽性的例數(shù)分別為18例(15.52％)和34例(29.31％)。與免疫抑制方案有關(guān)的獨立危險因素為術(shù)后服用FK506(r=0.232，P=0.012)，而服用

13、CsA則顯示了負相關(guān)關(guān)系(r=-0.232，P=0.012)。聯(lián)合應(yīng)用免疫抑制藥物方面，CsA+MMF組合顯示仍顯示為負相關(guān)關(guān)系(r=0.236，P=0.11)，而FK506+MZR組合可能是引發(fā)病毒血癥的危險因素(r=-0.197，P=0.034)。DGF可能是受者術(shù)后尿中出現(xiàn)Decoy細胞的獨立危險因素(r=0.195，P=0.036)。
　　7、根據(jù)2009年歐洲KDIGO指南和2010美國移植學會指南方案，對24例BKV血

14、癥(包括4例BKVAN受者)陽性受者進行減少免疫抑制劑劑量或轉(zhuǎn)換免疫抑制劑方案等干預(yù)治療，未發(fā)現(xiàn)移植腎丟失和急性排斥反應(yīng)事件。
　　結(jié)論：
　　1、利用自行研究設(shè)計的BKV檢測試劑盒，可以對血或尿標本進行快速定性、定量檢測，具有敏感性高、特異性好和成本低的優(yōu)勢。
　　2、經(jīng)臨床實踐顯示，本研究所開發(fā)的BKV檢測試劑盒可適用于較大規(guī)模臨床工作的開展，可以作為免疫妥協(xié)狀態(tài)下患者BKV感染的篩查監(jiān)測以及BKVAN的預(yù)防和療效

15、評估的首選無創(chuàng)性實驗室工具，改變了現(xiàn)有技術(shù)中需要進行組織活檢的現(xiàn)狀。
　　3、腎移植術(shù)后第3個月是受者發(fā)生BKV感染的高峰時段，此段時間需密切監(jiān)測尿中Decoy細胞及尿、血標本中BKV DNA載量變化，及時對BKV血癥受者進行臨床干預(yù)，可減少移植受者進展為BKAVN的幾率。
　　4、應(yīng)用本研究中心開發(fā)的BKV檢測試劑盒，當血BKV DNA載量()105 copies/ml或尿BKV DNA載量()107 copies/ml時

16、預(yù)測移植術(shù)后受者進展為BKVAN的幾率較大，可將以上兩項指標作為診斷BKVAN進展的閾值或陽性指標。
　　5、移植術(shù)前受者BKV血癥陽性是術(shù)后BKV血癥發(fā)生的一般臨床獨立危險因素，服用FK506或FK506+MZR的免疫抑制劑方案是術(shù)后BKV血癥和進展為BKVAN的免疫相關(guān)獨立危險因素。因此移植術(shù)前對供、受者進行常規(guī)的BKV篩查是預(yù)防和減少術(shù)后進展為BKV血癥和BKVAN的有效措施之一。對術(shù)前BKV血癥陽性受者，術(shù)后更應(yīng)密切監(jiān)測B