腫瘤限制性復(fù)制腺病毒與殺基因肝癌基因治療.pdf

1、上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文腫瘤限制性復(fù)制腺病毒與自殺基因肝癌基因治療姓名：李鋒申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：錢(qián)關(guān)祥2003.5.1P落第二壓科土事諺t雪謹(jǐn)論土將PNP基因通過(guò)12個(gè)glycineLinker連接于CDglyTK融合基因上，構(gòu)建出pcDNAPNPglycDglyTK真核表達(dá)載體，并利用脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染三種肝癌細(xì)胞株HepG2，BEL7402和SMMC7721。我們首先通過(guò)RTPCR、Northern

2、，Western等方法驗(yàn)證了融合基因的表達(dá)，證明我們構(gòu)建的融合基因可通過(guò)脂質(zhì)體有效介導(dǎo)在細(xì)胞中表達(dá)。并用MTT實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證融合基因的細(xì)胞毒效應(yīng)。結(jié)果表明融合基因在三種前藥單獨(dú)添加時(shí)均可發(fā)生腫瘤殺傷效應(yīng)，三種藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)其具有明顯的協(xié)同效應(yīng)。對(duì)AFP的細(xì)胞株BEL7402和HepG2在前藥濃度為fludarabine05Itg／ml，5FCl001xg／ml，GCVl01ag／ml時(shí)，可明顯抑制腫瘤的增殖。據(jù)此我們選擇了該濃度作為腫瘤細(xì)胞殺

3、傷的依據(jù)，進(jìn)一步作了細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)在該濃度的前藥作用下細(xì)胞可出現(xiàn)明顯的凋亡，三種細(xì)胞BEL7402、SMMC7721、HepG2凋亡細(xì)胞百分比分別為6265％、641％、5634％，較單一的PNP基因作用有明顯提高。我們也觀察到，在PNP／fludarabine系統(tǒng)作用相對(duì)較弱的SMMC7721細(xì)胞中，融合基因加三種前藥的療效明顯增強(qiáng)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明我們構(gòu)建的融合基因具有良好的腫瘤殺傷效應(yīng)。由于腺病毒載體的自身特點(diǎn)，其在腫瘤基

4、因治療中倍受重視。我們采用Stratagen公司的第二代細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建腺病毒的方法成功構(gòu)建了腺病毒載體AdCMVPNPglyCDglyTK，在此基礎(chǔ)上我們對(duì)HepG2和Hep3B細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞增殖和殺傷的研究，結(jié)果表明AD—CMVPNPglyCDglyTK同樣具有良好的腫瘤殺傷和抑制腫瘤增殖的效應(yīng)。這一步工作為PNPglyCDglyTK融合基因進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。三、AFP啟動(dòng)子活性研究本研究中設(shè)計(jì)了四種AFP反

5、應(yīng)元件，分別是帶增強(qiáng)子元件的突變型和野生型AFPTRE和不帶增強(qiáng)子成分的突變型和野生型AFP啟動(dòng)子調(diào)控的EGFP表達(dá)載體和luceferase表達(dá)載體，在多種細(xì)胞中驗(yàn)證了這四種反應(yīng)元件的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果表明帶增強(qiáng)子成分的AFPTRE較無(wú)增強(qiáng)子成分的AFPTRE在AFP高表達(dá)的細(xì)胞株Hep3B、HepG2和BEL7402中其活性顯著得到增強(qiáng)，但在AFP一的其他多種細(xì)胞株中四種AFPTRE均只有極低的活性。突變型和野生型的AFPTRE之間并未