腦組織特異表達鈣結合蛋白-D28k轉基因小鼠的制備與鑒定.pdf

1、鈣結合蛋白-D28K(Calbindin D-28k，CaBP-D28k)是鈣結合蛋白家族重要成員，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)，能通過與鈣離子、胱天蛋白酶-3、細胞膜三磷酸腺苷二脂酶和P38等結合調(diào)控其活性。在帕金森病(Parkinson's disease，PD)患者腦黑質致密區(qū)存在少量抗變性能力很強的DA能神經(jīng)元細胞，其共同特征是胞漿內(nèi)都含CaBP。在遇到缺血和神經(jīng)興奮性毒性時，CaBP陽性神經(jīng)元細胞能夠存活，提示CaBP對神經(jīng)細胞具有保護

2、作用。細胞凋亡是包括PD在內(nèi)的許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中神經(jīng)元細胞退行性病變的重要方式，而胞內(nèi)鈣離子超載是神經(jīng)元細胞發(fā)生凋亡的誘因之一。作為一種鈣離子快速緩沖蛋白，CaBP通過與鈣離子結合對各種生物化學信號發(fā)生反應，限制細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的過度升高，作為酶激活劑激活Ca2+-ATP酶調(diào)節(jié)鈣離子的濃度，通過調(diào)節(jié)離子通道來促進鈣離子的擴散，在神經(jīng)元細胞出現(xiàn)長時間高強度神經(jīng)活動時保護細胞免受鈣超載的損害。增加DA神經(jīng)細胞內(nèi)CaBP量可防止其產(chǎn)生退行

3、性病變，達到治療PD的目的。對于如何增加DA神經(jīng)細胞內(nèi)CaBP的量，目前主要局限于體外細胞水平和以病毒為載體的體內(nèi)短暫表達，而CaBP-D28k在DA神經(jīng)細胞內(nèi)表達的轉基因動物模型未見報道，對DA神經(jīng)細胞保護機制還需進一步研究。
　　 本研究用腦組織特異酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)基因啟動子構建CaBP-D28k表達載體，用二甲基亞砜(DMSO)處理精子制備轉基因小鼠，建立用于PD研究的轉基因動

4、物模型。首先，根據(jù)發(fā)表的小鼠TH啟動子序列設計引物，用重疊PCR擴增小鼠TH啟動子，測序正確后構建重組表達質粒pTH-EGFP，用脂質體分別轉染TH+MN-9D細胞和TH-ECV細胞，根據(jù)EGFP報告基因的表達與否來驗證TH啟動子的調(diào)控能力。在此基礎上，用PCR克隆5個不同的TH啟動子基因片段，用相同策略獲得能驅動外源基因在腦組織中特異表達的TH啟動子核心序列。然后，用RT-PCR從小鼠腦組織中擴增CaBP-D28k cDNA，將其克隆

5、入含TH啟動子的表達載體，獲得的重組載體pTH-CB經(jīng)脂質體包裹后轉染MN-9D細胞，用RT-PCR、免疫沉淀法檢測CaBP-D28k的表達，用6-羥多巴胺復制細胞凋亡模型，用細胞原位免疫印跡法檢測轉染細胞中抗凋亡因子bcl-2的表達，用Hoechst染色、胱天蛋白酶-3活性檢及鈣依賴性磷脂結合蛋白Annexin V/PI檢測法，評價CaBP的抗細胞凋亡作用。進而將DMSO處理的精子與pTH-CB孵育，將體外受精獲得的胚胎移植小鼠，用W

6、estern blot等試驗檢測PCR檢測轉基因陽性鼠黑質部CaBP-D28k表達，用MPTP復制PD模型，通過自主活動、游泳實驗、懸掛實驗等研究轉基因鼠的行為學以及黑質致密部TH陽性細胞數(shù)的改變，來驗證CaBP的抗MPTP對神經(jīng)細胞的損傷作用。結果表明，克隆的TH啟動子為3650bp，其序列與發(fā)表的TH啟動子序列完全一致，能驅動EGFP報告基因在MN-9D細胞中表達。用PCR擴增的450bp、1500bp、2000bp、2400bp、

7、3650bp TH啟動子序列構建報告載體，其轉染的MN-9D細胞培養(yǎng)中EGFP陽性細胞的比例無統(tǒng)計學顯著性差異(分別為8.01％、7.97％、7.85％、7.72％、7.74％)，但在其轉染的TH-ECV細胞培養(yǎng)中，EGFP陽性細胞比例分別為6.51％、6.35％、6.71％、0.89％、1.02％，3650bp和2400bp啟動子在TH-細胞中的表達調(diào)控能力受到明顯抑制，初步證明TH啟動子中組織特異性調(diào)控元件主要位于2400bp～20

8、00bp區(qū)域。
　　 用RT-PCR從小鼠腦組織中擴增的785bp CaBP-D28k cDNA與已報道的序列完全一致，用TH啟動子調(diào)控的CaBP-D28k表達載體轉染MN-9D細胞，其CaBP-D28k mRNA及蛋白表達量顯著高于對照組，表達的CaBP能顯著促進細胞內(nèi)bcl-2表達，能抑制Caspase-3活性，并能顯著降低細胞的凋亡數(shù)。
　　 用DMSO處理的精子共獲得96只后代小鼠，其中4只為PCR檢測陽性，2只

9、能穩(wěn)定傳代目的基因，其腦黑質部、腹側被蓋區(qū)的CaBP-D28k表達量顯著高于正常小鼠，而其海馬、大腦皮層的CaBP-D28k表達量與正常鼠無明顯差異，初步說明TH啟動子能驅動外源CaBP-D28k基因在DA神經(jīng)細胞中表達，獲得了腦組織特異表達CaBP-D28k的轉基因小鼠品系。MPTP造模試驗結果表明，轉基因鼠黑質致密部TH陽性細胞數(shù)和行為學變化差異不顯著，而正常鼠黑質致密部TH陽性細胞數(shù)和行為學變化差異顯著，表明腦內(nèi)DA神經(jīng)細胞中Ca