三維納米石墨烯抑制肝癌HepG2細(xì)胞生長的機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌（簡稱肝癌）是全球發(fā)病率排名第五的癌癥，具有很高的致死率，在癌癥造成的死亡中排名第三。由于肝癌在確診時(shí)往往已發(fā)展到中晚期，失去了手術(shù)的時(shí)機(jī)。臨床上常用的化療藥物靶向性差，具有很大的毒副作用，而且肝臟作為人體最大的解毒器官，很容易出現(xiàn)耐藥性的問題，因此傳統(tǒng)的化療對(duì)肝癌的治療效果有限。納米藥物的興起為腫瘤的治療提供了新的思路，利用納米藥物對(duì)腫瘤組織獨(dú)特的EPR（permeability and retention,EPR）效應(yīng)和易于

2、靶向修飾的特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的選擇性殺傷。三維納米石墨烯（three dimensional nanographene,以下簡稱NG）是國家納米藥物工程技術(shù)研究中心在三蝶烯分子上三取代六苯并蔻合成的一類新型納米材料，它具有獨(dú)特的熒光性能、大共軛體系和超分子自組裝性能。選擇肝癌細(xì)胞系HepG2和正常肝細(xì)胞系HL7702為研究對(duì)象，對(duì)NG的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行初步探索，主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1)以THF為溶劑，通過溶劑揮發(fā)法制

3、得了NG納米粒水溶液。動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)得NG納米粒的粒徑為169 nm，PDI為0.019。TEM顯示NG納米粒為直徑50 nm的球體。熒光光譜掃描的結(jié)果顯示NG納米粒在360 nm-420 nm區(qū)域有強(qiáng)激發(fā)，在470、500和556 nm處有三個(gè)發(fā)射峰。
　　2)采用MTT法評(píng)價(jià)了NG納米粒對(duì)HepG2細(xì)胞和HL7702細(xì)胞的毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NG納米粒能夠選擇性殺傷HepG2細(xì)胞，而對(duì)HL7702細(xì)胞毒性較小?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)表明NG納

4、米粒在低濃度下能選擇性抑制 HepG2細(xì)胞的生長。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法顯示NG納米粒是通過凋亡造成細(xì)胞死亡的。Western blot的結(jié)果顯示凋亡過程中發(fā)生了PARP的裂解，而且HepG2細(xì)胞中γ-H2AX水平增加，表明細(xì)胞中發(fā)生了DNA雙鏈的斷裂。
　　3)為了研究NG納米粒的選擇性細(xì)胞毒性是否與不同的細(xì)胞攝取效率和內(nèi)吞途徑有關(guān)，使用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞攝取納米粒的過程，并用熒光分光光度計(jì)對(duì)進(jìn)入胞內(nèi)的納米

5、粒進(jìn)行定量。結(jié)果表明HepG2細(xì)胞對(duì)NG納米粒的攝取效率比HL7702細(xì)胞更高。進(jìn)一步通過內(nèi)吞抑制劑研究了兩種細(xì)胞攝取NG納米粒的內(nèi)吞途徑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞主要通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑攝取NG納米粒，而網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞共同參與了HL7702細(xì)胞對(duì)NG納米粒的攝取。共定位的結(jié)果表明兩種細(xì)胞攝取的NG納米粒都轉(zhuǎn)運(yùn)到了溶酶體和高爾基體，而且HepG2細(xì)胞中有部分NG納米粒定位于線粒體。
　　4)為了進(jìn)一步揭

6、示NG納米粒特異性殺傷HepG2細(xì)胞的機(jī)理，比較了NG納米粒刺激下兩種細(xì)胞內(nèi)氧化壓力的變化。結(jié)果顯示HepG2細(xì)胞具有更高的基礎(chǔ)ROS水平，在受到NG納米粒刺激后產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species ROS），HL7702細(xì)胞僅產(chǎn)生少量的ROS。此外，NG納米粒更容易耗竭HepG2細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽（GSH）?？寡趸瘎?N-乙酰-半胱氨酸（N-Acetylcysteine，NAC）不僅能夠抑制NG納米粒導(dǎo)致的R

7、OS積累和GSH的消耗，而且能夠逆轉(zhuǎn)NG納米粒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡?；诰€粒體在產(chǎn)生ROS中的重要作用，我們用熒光探針JC-1檢測(cè)了兩種細(xì)胞在NG納米粒影響下線粒體膜電位（Mitochondrial membrane potential，MMP）的變化，結(jié)果顯示HepG2細(xì)胞的MMP在NG納米粒作用下迅速喪失，而HL7702細(xì)胞MMP的下降較小，抗氧化劑NAC能恢復(fù)NG納米粒誘導(dǎo)的MMP下降，這說明NG納米粒導(dǎo)致的線粒體損傷是造成ROS累積的

8、重要原因。
　　5)為了進(jìn)一步揭示NG納米粒產(chǎn)生ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，研究了HepG2細(xì)胞內(nèi)氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子在NG納米粒誘導(dǎo)下活性的變化。結(jié)果表明在NG納米粒刺激下HepG2細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）、活化蛋白-1（AP-1）和p53的活性受到了顯著的激活，而且這種激活作用可以被NAC抑制。詳細(xì)研究了NF-κB在NG納米粒誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)理，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染野生型IKKα和IKKβ能增加NG納米

9、粒誘導(dǎo)的NF-κB激活，而轉(zhuǎn)染IKKα和IKKβ的負(fù)顯性突變體（IKKαK44A和IKKβK44A）能減輕NG納米粒誘導(dǎo)的NF-κB激活。進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染IKK的負(fù)顯性突變體或者IKK的化學(xué)抑制劑小白菊內(nèi)酯都能增加HepG2細(xì)胞對(duì)NG納米粒的敏感性，表明IKK/NF-κB信號(hào)通路參與NG納米粒誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用，且NF-κB在NG納米粒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起著抗凋亡的作用。
　　本文發(fā)現(xiàn)NG納米粒能夠選擇性誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋

10、亡，而對(duì)HL7702細(xì)胞毒性較小，提示新型碳納米材料NG在肝癌治療中具有潛在價(jià)值。進(jìn)一步的研究證明了NG納米粒的細(xì)胞毒性是通過誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS產(chǎn)生的，而且兩種細(xì)胞敏感性的差異有兩方面原因：首先是兩種細(xì)胞對(duì)NG納米粒的內(nèi)吞途徑不同導(dǎo)致了攝取效率的差異，其次是由于HepG2細(xì)胞具有更高的基礎(chǔ)氧化壓力，進(jìn)一步的氧化刺激很容易超過細(xì)胞的抗氧化閾值，導(dǎo)致細(xì)胞氧化平衡體系崩潰。這些結(jié)果為利用納米藥物治療腫瘤提供了新的思路，可以概括為細(xì)胞對(duì)納米粒的