VB1誘異肝癌HepG2細(xì)胞生長抑制和調(diào)亡的機(jī)制研究.pdf

1、第一章 VB1對肝癌Hep G2細(xì)胞生長及其誘導(dǎo)血管生成的影響
　　目的:檢定純化牡荊脂素化合物1(purified vitexin compound1，VB1)對人肝癌Hep G2細(xì)胞生長及其誘導(dǎo)血管生成的抑制作用。
　　方法:體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系Hep3B、Huh-7和Hep G2與永生化人胚肝細(xì)胞系L-02以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系HUVE-12。與常規(guī)化療藥物氟尿嘧啶(fluorouracil，5-FU)對照，MTT比色

2、法檢測VB1對不同肝癌細(xì)胞系增殖活性的影響。平皿集落形成法和軟瓊脂培養(yǎng)集落形成法檢測不同濃度VB1對Hep G2細(xì)胞生長的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測VB1對細(xì)胞周期進(jìn)程的影響。內(nèi)皮管結(jié)構(gòu)形成試驗(yàn)評價VB1對肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)血管生成的影響。
　　結(jié)果:1.VB1以濃度依賴方式抑制人肝癌細(xì)胞增殖，不同細(xì)胞系，其敏感性不同;Hep G2細(xì)胞系較敏感，Hep3B細(xì)胞系中等敏感，對其相對不敏感細(xì)胞系為Huh-7細(xì)胞;VB1對永生化人胚肝L-

3、02細(xì)胞作用微弱。在相同藥物濃度下，VB1抑制肝癌細(xì)胞增殖活性作用優(yōu)于常規(guī)化療藥物5-FU(p＜0.05)，并其選擇性較高。
　　2.平皿集落形成、軟瓊脂培養(yǎng)集落形成法結(jié)果顯示，5.0、10.0μM VB1處理的細(xì)胞集落數(shù)均顯著低于對照組(p＜0.05)，隨著VB1濃度的增加，Hep G2細(xì)胞集落數(shù)逐漸減少，VB1對Hep G2細(xì)胞生長抑制作用優(yōu)于相同濃度的5-FU。說明VB1對細(xì)胞的錨定依賴性生長和錨定非依賴性生長能力有顯著抑制

4、作用，呈濃度依賴性。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示不同濃度VB1處理Hep G2細(xì)胞，處于細(xì)胞周期G1期的細(xì)胞比率分別為49.2％、53.2％、63.4％，顯著高于對照組的42.2％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。隨著VB1濃度增加，Hep G2細(xì)胞周期G1期的細(xì)胞由對照組的42.2％升高為63.4％，而S期細(xì)胞百分率減少，由對照組的46％下降至24.3％。
　　4.內(nèi)皮管結(jié)構(gòu)形成試驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度VB1孵育Hep G2

5、細(xì)胞的條件培養(yǎng)基抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系HUVE-12細(xì)胞管結(jié)構(gòu)形成能力，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，隨著VB1濃度的增加，其抑制作用增強(qiáng)。
　　結(jié)論:純化牡荊脂素化合物1(VB1)具有抑制肝細(xì)胞癌Hep G2細(xì)胞增殖、生長和誘導(dǎo)血管生成作用。
　　第二章 VB1對肝癌Hep G2細(xì)胞凋亡的影響
　　目的:檢測VB1誘導(dǎo)人肝癌Hep G2細(xì)胞凋亡作用。
　　方法:碘化丙啶染色流式細(xì)胞術(shù)定量檢測不同

6、濃度VB1作用Hep G2細(xì)胞的凋亡率;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定細(xì)胞組蛋白/DNA碎片水平;DNA瓊脂糖凝膠電泳法觀察細(xì)胞DNA斷裂。Caspase活性檢測試劑盒測定細(xì)胞caspase-3/8/9活性。
　　結(jié)果:1.VB1增高Hep G2細(xì)胞凋亡率，表現(xiàn)為sub-G1期細(xì)胞百分率由2.4％增至30.2％，并呈劑量依賴性，其體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用優(yōu)于常規(guī)化療藥物5-FU(P＜0.05)。
　　2.ELISA檢測結(jié)果表明

7、，不同濃度VB1或5-FU(10.0μM)作用24 h，HepG2細(xì)胞內(nèi)組蛋白/DNA碎片水平顯著高于溶媒對照組(P＜0.05)，且5.0μM和10.0μM的VB1處理的細(xì)胞組蛋白/DNA碎片水平顯著高于2.5μM VB1處理組(P＜0.05); VB1(10.0μM)誘導(dǎo)細(xì)胞組蛋白/DNA碎片水平顯著高于相同濃度5-FU(P＜0.05)。
　　3.DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示VB1處理誘導(dǎo)DNA核小體間斷裂，呈典型的細(xì)胞凋亡特征

8、性“梯形”條帶圖譜，然而，溶媒對照組未見典型的“梯形”條帶。
　　4.VB1以劑量依賴方式激活Hep G2細(xì)胞caspase-3/8/9，通用型caspase抑制劑zVAD-fmk預(yù)處理后caspase-3、caspase-8和caspase-9的活化片段明顯減少(p＜0.05)，caspase-3抑制劑zDEVD-fmk、caspase-8抑制劑zIETD-fmk和caspase-9抑制劑zLEHD-fmk預(yù)處理可減弱VB1激活

9、caspase-3、caspase-8和caspase-9的作用(p＜0.05)。
　　結(jié)論:純化牡荊脂素化合物1(VB1)以濃度依賴方式誘導(dǎo)人肝細(xì)胞癌Hep G2細(xì)胞凋亡，并依賴于caspase活化級聯(lián)反應(yīng)。
　　第三章 VB1誘導(dǎo)肝癌Hep G2細(xì)胞生長抑制及凋亡作用的機(jī)制研究
　　目的:探討VB1誘導(dǎo)人肝癌Hep G2細(xì)胞生長及其血管生成抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用分子機(jī)制。
　　方法:Western blot檢

10、測不同濃度VB1對Hep G2細(xì)胞PI3K/AKT及MAPK信號分子蛋白表達(dá)以及磷酸化水平影響;同時，檢測FOXO3a總蛋白及相應(yīng)磷酸化蛋白的表達(dá)水平;最后，分析FOXO3a下游細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平改變。Western blot和ELISA檢測不同濃度VB1對Hep G2細(xì)胞VEGF合成和分泌的影響。采用藥理學(xué)特異性阻斷劑(MEK抑制劑PD98059)和小干擾RNA(AKT特異性siRNA和FOXO3a特異性siRN

11、A)抑制相應(yīng)靶基因表達(dá)或活性以研究VB1調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖、凋亡信號傳導(dǎo)作用的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:1.Western blot結(jié)果顯示，隨著VB1濃度的升高，Hep G2細(xì)胞RAS、p-PI3K、p-AKT、p-ERK蛋白的表達(dá)逐漸減弱，p-JNK蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，但不影響其總蛋白的表達(dá)水平。
　　2.隨著VB1作用濃度的升高，Hep G2細(xì)胞FoxO3a磷酸化水平依次降低，F(xiàn)OXO3a下游靶基因產(chǎn)物p21、p27、TRAI

12、L、DR4、DR5、Bim蛋白表達(dá)水平逐漸上調(diào)，Cyclin D1、Survivn蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)。
　　3.與溶媒對照組細(xì)胞相比，不同濃度VB1可明顯抑制Hep G2細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)及細(xì)胞培養(yǎng)液中VEGF的分泌(P＜0.05)。
　　4.AKT特異性siRNA、MEK抑制劑PD98059增強(qiáng)VB1抑制Hep G2細(xì)胞FOXO3a磷酸化的作用，F(xiàn)OXO3a特異性siRNA對p-AKT、AKT、p-ERK1/2和ERK1/