一株ALV-J全基因序列分析及其RNAi重組腺病毒與DNA疫苗的試驗研究.pdf

1、禽白血病(avian leukosis，AL)是一種能引起禽類免疫抑制的腫瘤性疾病，由禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)引起，其中J亞型禽白血病病毒(subgroup J ALV, ALV-J)是目前養(yǎng)雞業(yè)最為常見、危害最為嚴重的亞群。雞群感染ALV后，可能會出現(xiàn)生產性能降低、免疫水平下降、出血、腫瘤和生長遲緩等病癥。目前并沒有很好的預防和治療ALV感染的疫苗和藥物，主要依賴種群的凈化。為了輔助凈化工作，課

2、題組構建了一個DNA疫苗和一個RNAi的重組腺病毒，本課題將通過動物試驗來驗證它們的實際效果。另外從臨床發(fā)病雞分離鑒定了一株ALV-J并進行了全基因序列分析。
　　本課題從廣東某雞場臨床發(fā)病的病雞體內采集病料，應用DF-1細胞培養(yǎng)分離病毒，通過對培養(yǎng)物的IFA、ELISA和PCR檢測，確定獲得一株ALV-J，命名為GDMM。通過特異性引物擴增獲得并完成了對該分離株的全基因組序列測定，經與14個來自兩廣地區(qū)的分離株及國內其他地方的參

3、考株進行比較分析，發(fā)現(xiàn)該分離株與廣西分離株GX14ZS14、GX14HG04及廣東參考株GDQY1201等之序列的相似性很高，尤其與GX14ZS14株的核苷酸相似性高達96.8％，且系統(tǒng)進化樹上與GX14ZS14親緣關系最近，同屬一分支。
　　為驗證課題組制備的RNAi重組腺病毒pAd-gp85-shRNA2對雞體內ALV-J感染的干擾效果，選擇蛋清p27抗原陽性且血漿病毒分離呈陽性的種雞群作為實驗對象，其中實驗組(28只產蛋母雞

4、)接種重組腺病毒100μL(1.6×109PFU)/只、對照組(28只產蛋母雞)注射PBS100μL。分別檢測試驗前后母雞的體重、其后代雛雞胎糞的p27抗原陽性率;同時在試驗后采集母雞的蛋清進行p27抗原檢測和抗凝血進行病毒分離培養(yǎng);接種后每周采集實驗組和對照組各5只母雞的抗凝血和分泌物，對ALV-J和重組腺病毒分別進行定量檢測。結果發(fā)現(xiàn)，實驗組和對照組母雞的體重無顯著差異;實驗組母雞蛋清p27抗原陽轉陰和血毒陽轉陰的個體均為25％，后

5、代雛雞胎糞p27抗原陽轉陰的個體有19％;在接種后2w，母雞體內的ALV-J拷貝數最少、重組腺病毒對ALV-J的干擾效率也最高，可達68％;接種后4w，母雞體內仍可檢測到重組腺病毒，與接種后4w時實驗組ALV-J拷貝數比對照組少的結果相一致，說明重組腺病毒在接種后4w仍能對母雞體內的ALV-J發(fā)揮干擾作用。
　　為驗證課題組構建的DNA疫苗pVAX1-Ub1-gp85-p27-p10誘導接種母雞產生抗體及其后代雛雞產生母源抗體的效

6、果，選擇蛋清p27抗原檢測陰性且ALV-J抗體也是陰性的產蛋母雞作為實驗對象。實驗組(25只產蛋母雞)接種DNA疫苗、對照組(25只產蛋母雞)注射PBS，2w后以同樣劑量重復注射一次。試驗前后分別稱量母雞的體重、檢測免疫母雞血清中的抗體及其后代雛雞血清中ALV-J的母源抗體。結果發(fā)現(xiàn)，實驗組與對照組母雞的體重無顯著差異，有28％的免疫母雞(7只)和8％(2只)母雞之后代小雞的抗體出現(xiàn)陰轉陽。
　　本課題研究的結果表明，從臨床發(fā)病雞