EGFR抑制劑及聯(lián)合放化療對頭頸鱗癌體外治療和療效預測.pdf

1、目的： 頭頸癌被認為是第七大常見腫瘤，其中鱗狀細胞癌(Squamous cell carcinoma of the head and neck，HNSCC)占頭頸癌的90％。手術、放療或手術聯(lián)合放療是頭頸癌治療的基礎。近年來，隨著放化療聯(lián)合治療模式的逐步建立，晚期病人生存率和局部控制率有了一定程度的提高。然而在頭頸癌放化療治療中仍然存在一些問題，如：放化療毒副作用大、腫瘤對放化療不敏感、治療后病人復發(fā)率高、5年生存率低等。迄今為

2、止，頭頸癌放化治療和療效預測仍是腫瘤治療的一個難題。 腫瘤特異性分子的靶向治療具有特異性強、在有效殺滅腫瘤細胞的同時不損傷正常組織的優(yōu)點，它是針對可能導致細胞癌變的環(huán)節(jié)，從分子水平逆轉這種惡性生物學行為，從而抑制腫瘤細胞生長的生物治療模式。其中表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)是當前分子靶向治療研究的熱點。EGFR是ErbB酪氨酸激酶受體。該家族共有4個成員即EGFR/

3、ErbB1，HER2/ErbB2，HER3/ErbB3及HER4/ErbB4。ErbB與特異的配體結合形成配體—受體二聚體，隨后發(fā)生自身磷酸化，激活其下游主要信號通路，調節(jié)細胞功能，如細胞增殖、凋亡、血管形成、細胞粘附等，可導致細胞癌變，進而發(fā)生浸潤及轉移等。研究表明，80％—90％頭頸鱗癌患者的EGFR為陽性。EGFR的過度表達與預后差、轉移快、生存期短和放化療不敏感等密切相關。 EGFR的靶向藥物主要有兩類：一類為單克隆抗

4、體，如西妥昔單抗(Cetuximab，Erbitux，IMC—C225)，它是特異性阻斷EGFR的IgG1單克隆抗體，針對受體胞外配體連接區(qū)，阻止配體與受體的結合而抑制受體的激活。另一類為小分子酪氨酸激酶抑制劑，如易瑞沙(Gefitinib，Iressa，ZD1839)，主要抑制受體胞內酪氨酸激酶活性區(qū)。 EGFR靶向藥物只起到抑制腫瘤的作用，不能殺傷腫瘤細胞，其有效率在10％左右。因此，靶向治療聯(lián)合放化療可能有利于提高療效，

5、減少副作用，是腫瘤治療的發(fā)展趨勢。 目前，在晚期頭頸鱗癌治療中，有學者報道Cetuximab聯(lián)合放療或化療提高了療效。但Gefitinib聯(lián)合放療是否也有相似的療效；Cetuximab聯(lián)合化療(Cisplatin)及常規(guī)放療是否能提高療效；以及對它們療效的預測，國內外未見報道。本實驗利用10株頭頸鱗癌細胞克隆模型，分別比較單藥治療、聯(lián)合治療對細胞生存活性的影響，同時檢測了10株HNSCC細胞的ErbB家族成員蛋白表達及信號通路關

6、鍵因子，預測EGFR抑制劑在頭頸鱗癌治療中的療效，為進一步提高頭頸鱗癌治療療效，合理應用靶向治療提供重要線索。 方法： 一、研究對象 新建的10株人頭頸鱗癌細胞系，標記為UT—SCC(本文簡寫為SCC)。SCC—8，SCC—9，SCC—11，SCC—19a，SCC—29，SCC—34和SCC—38來源于喉癌(其中SCC—9源于頸轉移，SCC—11源于復發(fā)病例)，SCC—24a1，SCC—24a2和SCC—40來源

7、于舌癌。 二、研究方法 1、細胞培養(yǎng)： 細胞系傳代于15—30代之間。10％熱滅活胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS) DMEM培養(yǎng)基貼壁生長，孵育箱培養(yǎng)，0.01％胰蛋白酶(trypsin)及0.02％K—EDTA消化傳代，每周傳代1—2次，細胞維持在對數(shù)生長狀態(tài)。 2、克隆形成率分析法： Ham’s F—12(15％ FBS)培養(yǎng)液。96孔培養(yǎng)板每孔細胞的接種數(shù)根據細胞植

8、盤率(Plating efficiency，PE)調整。加干預因素，孵育箱培養(yǎng)4周，倒置顯微鏡下觀查，每孔活細胞≥32個的孔作為陽性孔而計數(shù)。 3、Western blot方法： 檢測人HNSCC細胞ErbB家族成員蛋白表達和活性。細胞裂解液以相同蛋白量上樣，SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳，分別進行一抗、二抗雜交，ECL顯色。 4、RT—qPCR方法： 檢測人HNSCC細胞ErbB家族成員mRNA表達。

9、 (1) Primer Express software設計引物和Taqman探針。 (2)利用Trizol試劑提取細胞總RNA。 (3)重組質粒pEBS7—EGFR作為標準品，actin為對照。 三、實驗分組 1、96孔培養(yǎng)板克隆形成率分析法檢測HNSCC細胞對三種藥物(Cetuximab，Gefitinib，Cisplatin)的敏感性(IC70和IC50)。 實驗設細胞對照組和藥物(5種不

10、同濃度)處理組。 2、96孔培養(yǎng)板克隆形成率分析法檢測HNSCC細胞對Cetuximab或Gefitinib聯(lián)合放療療效。 Cetuximab/Gefitinib+Radiation： (1)單純放射組：分0 Gy，0.75 Gy，1.25 Gy，2.5 Gy，5.0 Gy和7.5 Gy單次照射。 (2)放射+藥物組：放射劑量同上。Cetuximab或Gefitinib IC70。 (3)放射+

11、藥物組：放射劑量同上。Cetuximab或Gefitinib IC50。 3、96孔培養(yǎng)板克隆形成計數(shù)法檢測HNSCC細胞對Cetuximab聯(lián)合順鉑(Cisplatin)及放療療效。 Cetuximab+Cisplatin+Radiation： (1)單純放射組：分0 Gy，0.75 Gy，1.25 Gy，2.5 Gy，5.0 Gy和7.5 Gy單次照射。 (2)放射+化療組：放射劑量同上。Cispl

12、atin IC70。 (3)放射+化療+藥物組：化放療方法同(2)，Cisplatin IC70，Cetuximab IC70。 (4)放射+化療+藥物組：化放療方法同(2)，Cisplatin IC70，Cetuximab IC50。 四、療效評價與統(tǒng)計分析 1、細胞植盤率(PE)： PE=—In(陰性孔數(shù)量/全部孔數(shù)量)/每孔使用細胞數(shù)量。 2、藥物敏感性： Cetuxim

13、ab，Gefitinib，Cisplatin的敏感性用IC50，IC70表示，即抑制50％，30％克隆形成所需的濃度。 3、聯(lián)合治療療效評價： (1)細胞存活分數(shù)(Survival fraction，SF)=(陽性孔數(shù)量/每孔使用細胞數(shù)量)×控制組每孔使用細胞數(shù)量/控制組中陽性孔數(shù)量。適用于線性二次(LQ)模型F=exp[—(αD+βD2)]，擬合劑量生存曲線，(D表示劑量，α和β為劑量效應系數(shù)，α：為單擊所產生的細胞死

14、亡，即細胞存活曲線的初斜率；β：由于損傷累積而導致細胞死亡)。 (2)通過數(shù)值整合獲得曲線下面積(Area under the curve，AUC)值等同于平均致死(失活)劑量，AUC=1/α+(1.0)(DF—1)。聯(lián)合放療AUC率=(藥物+放療)AUC/放療AUC；聯(lián)合放化療AUC率=(藥物+放療+化療)AUC/放療AUC。 (3)聯(lián)合治療療效評價采用細胞存活分數(shù)(SF)和AUC率的比較分析，比較分析采用t檢驗。藥物

15、劑量對超相加作用的影響采用單因素方差分析(ANOVA)。Cetuximab或Gefitinib聯(lián)合放療療效和Cetuximab聯(lián)合化療(Cisplatin)及放療的療效評價采用“相加效應”(P>0.05)即藥物+放療(或放化療)的附加效應；“超相加效應”(P<0.05)即大于藥物+放療(或放化療)的附加效應亦即協(xié)同效應。 4、相關性分析： ErbB表達與Cetuximab或Gefitinib藥物敏感性(IC50)及放療

16、敏感性(AUC)的相關性采用Spearman統(tǒng)計分析，P<0.05為有相關性。 結論： 1、HNSCC體外研究表明，Cetuximab或Gefitinib聯(lián)合放療的療效優(yōu)于單獨放療(相加效應)，Gefitinib(5株超相加效應)對HNSCC細胞的療效優(yōu)于Cetuximab(1株超相加效應)。在Cetuximab聯(lián)合放療中，Cetuximab IC50劑量組作用最敏感的兩株細胞與Cetuximab單藥治療中最敏感的兩株細

17、胞相一致。在Cetuximab聯(lián)合Cisplain及放療中，使用Cetuximab(IC70/IC50)和低劑量Cisplatin(IC70)可以提高療效(相加效應)，優(yōu)于單純放療或放化療，并且超相加作用的兩株細胞與Cetuximab單藥治療中最敏感的兩株細胞相一致。結果提示Cetuximab的敏感性可以預測Cetuximab聯(lián)合放療或聯(lián)合放化療的療效。 2、pErbB2和ErbB3表達水平與HNSCC細胞對Gefitinib抵