血管生成素對腎小球內皮細胞衰老的影響及其機制探討.pdf

1、第一部分過氧化氫誘導腎小球內皮細胞衰老模型的建立
　　目的:
　　在體外培養(yǎng)條件下,正常體細胞在經(jīng)過有限次數(shù)的增殖分裂后即進入不可逆轉的分裂停滯狀態(tài),這種由于在連續(xù)的細胞分裂中端粒逐漸縮短所引發(fā)的現(xiàn)象稱為細胞復制性衰老。除此以外,氧化應激、某些癌基因過度表達、紫外線、化學誘變劑等應激因素亦可誘導細胞進入一種應激性早衰狀態(tài)。細胞早衰不依賴端粒的縮短,并且與復制性衰老細胞在形態(tài)、功能及生物學特性上具有許多相同的特征。細胞衰老是生

2、物整體衰老的基礎,以細胞為模型的衰老生物學研究是當前老年醫(yī)學研究的重要內容。H2O2是一種廣泛使用的致細胞早衰的誘導劑,通過DNA損傷機理誘導細胞衰老,且外源性上調端粒酶的活性不能抑制其誘導衰老作用。因此本研究首先通過過氧化氫誘導,探討可否在體外建立成功而穩(wěn)定的腎小球內皮細胞(MGECs)衰老模型,從而為進一步的實驗奠定良好模型基礎。
　　方法:
　　應用體外細胞培養(yǎng)技術,培養(yǎng)小鼠腎小球內皮細胞,選擇過氧化氫(H2O2)作為

3、誘導物。設立正常對照組、H2O2組進行實驗。應用β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal)方法檢測衰老細胞陽性率,流式細胞術檢測細胞周期,Western blot免疫印跡法檢測p16蛋白的表達,通過分析H2O2對細胞衰老指標的影響鑒定其作用后是否可引起MGECs衰老。同時通過Hoechst-33342染色法及流式細胞術檢測H2O2對細胞凋亡的影響。
　　結果:
　　1.H2O2(50μmol/L)誘導7天后,在倒置相差顯微鏡下觀

4、察可見腎小球內皮細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,細胞體積增大,胞體扁平,呈現(xiàn)衰老細胞形態(tài);
　　2.SA-β-Gal染色實驗結果顯示:正常細胞SA-β-Gal染色幾乎無陽性表達(0.76±0.24％),隨H2O2作用時間延長陽性細胞數(shù)逐漸增多;H2O2作用3天即可觀察到少量SA-β-Gal染色陽性衰老細胞(13.12±1.81％)的出現(xiàn),繼續(xù)予以H2O2作用7天后SA-β-Gal染色陽性細胞可達70.47％;
　　3.對細胞周期的分析

5、發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,H2O2具有阻止腎小球內皮細胞進入增殖期(S期),而將細胞周期阻滯于靜止期(G1期)的作用,差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);
　　4.Western blot實驗結果顯示,與正常對照組相比H2O2組p16蛋白的表達顯著增高(Control:21.09±0.67vs.H2O2:69.39±4.10),差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);
　　5.hoechest-33342著染后H2O2組并未出現(xiàn)明

6、顯凋亡樣細胞改變,同樣流式細胞術檢測顯示正常對照組及H2O2組細胞G1峰前均無凋亡峰出現(xiàn),細胞凋亡率無顯著性差異(3.19±0.49％vs3.26±0.39％,P＞0.05)。
　　結論:
　　過氧化氫在體外能成功誘導腎小球內皮細胞衰老。H2O2(50μmol/L)誘導7天后衰老相關SA-β-Gal染色陽性,細胞周期阻滯于G1期,p16蛋自表達上調。且H2O2作用后細胞無異常凋亡發(fā)生。過氧化氫誘導腎小球內皮細胞衰老的模型成功

7、、可信。
　　第二部分血管生成素對過氧化氫誘導的腎小球內皮細胞衰老的作用研究
　　目的:
　　衰老是一個自然進程,在所有物種中都有此現(xiàn)象,并導致很多器官出現(xiàn)退行性改變。腎臟是受衰老影響最明顯的器官之一,腎臟功能隨衰老進程逐漸減退。腎臟衰老時存在血管形成異常,表現(xiàn)為局灶性腎小管周圍及腎小球毛細血管密度減少;隨著年齡的增長,腎小球出現(xiàn)內皮細胞進行性減少和丟失。但目前有關腎臟毛細血管改變與衰老相關腎臟病變的直接關系尚未明了。

8、血管生成素(Ang)是一組內皮細胞特異性生長因子,可以有效促進內皮細胞的增殖、分化、介導新生血管管腔形成。Angl可促使Tie2磷酸化,提高內皮細胞的存活能力,促進血管生成,而Ang2則作用相反,能抑制Ang1介導的Tie2活化。本部分研究擬探討血管生成素系統(tǒng)是否能夠調控腎小球內皮細胞的衰老,進而影響腎小球內皮細胞的功能及腎臟新生血管的生成,并對其作用機制進行初步探討。
　　方法:
　　體外培養(yǎng)小鼠腎小球內皮細胞,設立正常對

9、照組、H2O2組、Ang1組、Ang2組進行實驗。應用H2O2誘導MGECs衰老,通過β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal)、流式細胞術檢測細胞周期、Western blot檢測p16蛋白表達評估細胞衰老指標的變化。應用硝酸還原酶法檢測內皮細胞NO的分泌量,ELISA方法檢測內皮細胞vWF的分泌量,Matrigel凝膠實驗檢測內皮細胞血管生成能力,探討血管生成素對內皮細胞功能的影響。比色法測定細胞裂解液中的丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(G

10、SH)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的水平。Western blot方法檢測Tie2、ERK2/2信號通路的變化。
　　結果:
　　1.血管生成素對腎小球內皮細胞衰老指標的影響:H2O2組SA-β-Gal陽性率增高,Ang1作用后細胞SA-β-Gal著色變淺、陽性率降低,與H2O2組相比其陽性率下降達到51.80％(P＜0.05),而Ang2組和H2O2組之間SA-β-Gal陽性率無顯著性差異(P＞0.05

11、);H2O2誘導衰老后細胞周期阻滯于G1期,Ang1組G1期細胞比例下降至74.50±0.16％,S期細胞比例上升至18.89±0.68％,與H2O2組相比差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),但Ang2組G1期及S期細胞數(shù)與H2O2組無明顯差異(P＞0.05);H2O2組p16蛋白表達增高,Ang1作用后p16表達水平較H202組下降44.30％(P＜0.05),但Ang2對p16蛋白表達無影響(P＞0.05)。
　　2.血管生成素

12、對腎小球內皮細胞功能的影響:H2O2組腎小球內皮細胞NO分泌量明顯減少,Ang1組細胞NO分泌顯著增加(H2O2:10.26±0.69vs.Ang1:15.61±1.61,P＜0.05),Ang2組NO分泌量與H2O2組無明顯差異(Ang2:10.15±0.42,P＞0.05);H2O2組vWF含量明顯升高(P＜0.05),Ang1作用后vWF含量顯著降低(Ang1:5.13±0.69vsH2O2:9.88±0.27,P＜0.05),而

13、Ang2對vWF分泌無明顯影響(Ang2:10.02±0.31,P＞0.05);H2O2組MGECs管狀結構形成能力顯著抑制,Ang1組細胞管狀結構形成明顯增加(P＜0.05),而Ang2組則與衰老組無明顯差異。
　　3.血管生成素對腎小球內皮細胞氧化應激指標的影響:H2O2組MDA含量增加,與H2O2組相比,Ang1組MDA含量降低(H2O2;10.31±0.22vs.Angl;5.02±0.47,P＜0.05),而Ang2組M

14、DA含量則無顯著變化(Ang2;9.13±0.81,P＞0.05);與正常對照組相比,H2O2組GSH、SOD、CAT活性均明顯降低,與H2O2組相比,Ang1作用后GSH、SOD、CAT活性均顯著升高(P＜0.05),但Ang2組GSH、SOD、CAT活性則無顯著性差異。
　　4.血管生成素對Tie2-ERK1/2通路的影響:Westen blot結果顯示Ang1組P-Tie2水平明顯增高(H2O2:4.12±2.06vs.An

15、g1:71.09±2.15,P＜0.05),Ang2組P-Tie2無明顯變化(Ang2:10.07±3.16,P＞0.05);Ang1能顯著提高細胞P-ERK1/2水平(P＜0.05),但Ang2作用未能引起P-ERK1/2的明顯變化(P＞0.05)。
　　結論:
　　Ang1對過氧化氫誘導的腎小球內皮細胞衰老有保護作用,可以有效減少細胞的衰老程度,保護腎小球內皮細胞的正常功能,增強細胞抗氧化酶活性,拮抗H2O2引起的細胞氧

16、化損傷。同時,Ang1可以激活Tie2、ERK1/2的磷酸化進程。然而Ang2對內皮細胞無上述保護作用。
　　第三部分血管生成素1對腎小球內皮細胞衰老保護作用的機制探討
　　目的:
　　Ang1能與Tie2受體結合并活化Tie2受體,誘導磷酸化的ERK1/2表達升高,進一步發(fā)揮其對內皮細胞的增殖、粘附等的作用。在第二部分的研究中,我們的研究結果也提示Angl的確可以啟動內皮細胞Tie2及ERK1/2的磷酸化過程。Ang

17、l對H2O2所誘導的腎小球內皮細胞衰老的保護作用是否是通過激活Tie2-ERK1/2信號通路所致?為了更進一步探討Ang1對腎小球內皮細胞衰老保護作用的機制,我們用Ang1的天然拮抗劑.Ang2、Tie2受體的特異性抑制劑sTie2-Fc及MAPK信號通路MEK特異性抑制劑PD98059預處理腎小球內皮細胞,以明確Ang1對腎小球內皮細胞衰老的保護作用的信號通路。
　　方法:
　　應用體外細胞培養(yǎng)技術,培養(yǎng)小鼠腎小球內皮細胞

18、,設立正常對照組、H2O2組、Ang1組、Ang2+Ang1組、sTie2-Fc組、PD98059組進行實驗。應用H2O2誘導MGECs衰老,通過β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal)、流式細胞術檢測細胞周期、Western blot檢測p16蛋白表達評估細胞衰老指標的變化。應用硝酸還原酶法檢測內皮細胞NO的分泌量,ELISA方法檢測內皮細胞vWF的分泌量,Matrigel凝膠實驗檢測內皮細胞血管生成能力,探討血管生成素對內皮細胞功能的

19、影響。Western blot方法檢測Tie2、ERK1/2信號通路的變化。
　　結果:
　　1.Tie2-ERK1/2通路抑制劑對腎小球內皮細胞衰老指標的影響:與Ang1組比較,Ang2+Angl組、sTie2-Fc組及PD98059組SA-β-Gal陽性細胞數(shù)顯著增加(Ang2:63.94±2.05,sTie2-Fc:72.56±1.51,PD98059.73.31±2.73vs.Ang1:18.67±2.73,P＜0.

20、05);Ang2、sTie2-Fc及PD98059作用后,細胞周期分布比例仍呈現(xiàn)衰老細胞特征,細胞周期被阻滯于G1期,S期細胞較少,與Ang1組相比,差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);Ang2、sTie2-Fc及PD98059能阻斷Ang1對p16蛋白表達降低的作用(Ang2:58.39±2.02,sTie2-Fc:61.08±3.10,PD98059:62.19±3.72vs.Ang1:21.16±1.11,P＜0.05);
　

21、　2.Tie2-ERK1/2通路抑制劑對腎小球內皮細胞功能的影響:Ang2、sTie2-Fc及PD98059可以下調Ang1對內皮細胞NO分泌的促進作用(Ang2:11.92±0.44,sTie2-Fc:10.22±0.36,PD98059:10.87±0.66vs.Ang1:16.38±0.35,P＜0.05);與Ang1組相比,予以Ang2、sTie2-Fc及PD98059作用后細胞vWF分泌量顯著增加(P＜0.05);Ang2+A

22、ng1組、sTie2-Fc組及PD98059組細胞血管腔形成能力下降(Ang2:23.11±2.29,sTie2-Fc:15.21±3.31,PD98059:18.56±2.36vs.Ang1:57.66±3.17,P＜0.05);
　　3.Tie2-ERK1/2通路抑制劑對Tie2-ERK1/2通路的影響:Westenblot結果顯示Ang2及sTie2-Fc能顯著抑制Ang1引起的腎小球內皮細胞P-ERK1/2水平的提高(An